Page 72 - 《中国药房》2024年5期
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2.2 大鼠空腹血糖检测                                       （电压 100 V，电泳时间 2 h）分离并转移（电流 250 mA，
              末次给药后，利用动物血糖仪检测各组大鼠尾尖血                          转膜时间 2 h）到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，
          糖的变化，具体操作如下：大鼠禁食12 h后，将其装入大                         PVDF）膜上。以 5% 脱脂牛奶封闭后，在 4 °C 下将膜与
          鼠固定器，用刀片割破尾静脉，收集血液，利用血糖仪检                           一抗 HMGB1（稀释比例 1∶2 000）、RAGE（稀释比例 1∶
          测空腹血糖值。                                             1 000）、p-NF-κB p65（稀释比例1∶3 000）、NF-κB p65（稀
          2.3 大鼠机械痛阈值、热痛阈值检测                                  释比例1∶4 000）、GAPDH（稀释比例1∶2 000）孵育过夜。
              大鼠空腹血糖检测完成后，取所有大鼠进行机械痛                          次日，将膜与二抗（稀释比例 1∶4 000）一起在室温下孵
          阈值、热痛阈值检测。大鼠机械痛阈值的检测方式如                             育2 h。加入ECL试剂可视化蛋白，使用Image J软件对
          下：通过 Von Frey 仪刺激针刺激大鼠后肢足底中间部                       蛋白条带灰度值进行量化。采用目的蛋白条带灰度值
          位，刺激的压力由小逐渐变大，当大鼠出现缩足反应时                            与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值表示目的蛋白
          对应的压力值即为机械痛阈值。大鼠热痛阈值的检测                             的表达水平，以 p-NF-κB p65 与 NF-κB p65 蛋白的表达
          方式如下：将热板仪调到55 ℃恒温后，将大鼠置于热板                          水平比值表示NF-κB p65蛋白的磷酸化水平。
          上，记录大鼠抬脚或舔足反应时间，即为热痛阈值。                             2.9 统计学方法
          2.4 大鼠坐骨神经传导速度检测                                        使用GraphPad PRISM 9.00软件进行统计分析。符
              大鼠机械痛阈值、热痛阈值的检测完成后，利用刺                          合正态分布且方差齐的数据以 x±s 表示。多组间比较
          激电极针检测大鼠运动神经传导速度、感觉神经传导速                            采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 SNK-q 检
          度。运动神经传导速度检测方式如下：暴露并分离大鼠                            验。检验水准α＝0.05。
          坐骨神经，设置刺激电极针置于坐骨神经尾椎端的位置                            3 结果
          为 S 通道，电极针置于同侧腓肠肌的肌腹处的位置为 R                         3.1 穿心莲内酯对大鼠空腹血糖的影响
          通道，多通道生理信号记录仪记录肌肉动作电位的潜伏                                与对照组比较，DPN组大鼠空腹血糖显著升高（P＜
          期，并计算运动神经传导速度[神经传导速度（m/s）＝两                         0.05）；与 DPN 组比较，穿心莲内酯低、高剂量组和硫辛
          通道电极针之间的距离（mm）/肌肉动作电位潜伏期                            酸组大鼠空腹血糖均显著降低（P＜0.05），rHMGB1 组
         （ms）]。感觉神经传导速度检测方式如下：将刺激电极                           大鼠空腹血糖显著升高（P＜0.05），且穿心莲内酯的作
          针、记录电极针分别置于大鼠足踝内侧胫神经、坐骨神                            用具有明显的剂量依赖性（P＜0.05）；与穿心莲内酯高
          经尾椎端处，多通道生理信号记录仪记录感觉神经电位                            剂量组比较，穿心莲内酯高剂量+rHMGB1 组大鼠空腹
          潜伏期，并计算感觉神经传导速度[感觉神经传导速度                            血糖显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
         （m/s）＝两电极间的距离（mm）/感觉神经电位潜伏期                          表1 各组大鼠空腹血糖、机械痛阈值、热痛阈值比较
         （ms）]。                                                   （x±s，n＝12）
          2.5 标本收集及处理                                         组别               空腹血糖/（mmol/L）  机械痛阈值/g  热痛阈值/s
              上述指标检测完成后，腹腔注射2%戊巴比妥钠（40                        对照组                4.46±0.23  12.26±0.74  5.28±0.21
                                                              DPN组               18.51±1.23 a  3.87±0.16 a  13.34±0.58 a
          mg/kg）麻醉并处死大鼠，分离并收集坐骨神经，分为两
                                                              穿心莲内酯低剂量组          15.21±0.69 b  5.65±0.23 b  10.12±0.41 b
          部分（每部分 6 只大鼠），一部分固定于 4% 多聚甲醛中                       穿心莲内酯高剂量组          6.83±0.32 bc  10.26±0.41 bc  7.34±0.32 bc
          用于 HE 染色，另一部分保存于－80 ℃冰箱中用于                          硫辛酸组               6.81±0.30 b  10.34±0.36 b  7.31±0.30 b
          ELISA和Western blot实验。                               rHMGB1组            21.34±1.06 b  2.11±0.05 b  15.51±0.63 b
                                                              穿心莲内酯高剂量+rHMGB1组   11.56±0.48 d  7.75±0.31 d  11.13±0.44 d
          2.6 大鼠坐骨神经病理变化检测
                                                              F                   977.600   1 151.000  834.800
              将固定于 4% 多聚甲醛中 24 h 的坐骨神经脱水、石                    P                   ＜0.001       ＜0.001  ＜0.001
          蜡包埋后，切成5 μm厚的切片。再将切片脱蜡与水化，                             a：与对照组比较，P＜0.05；b：与DPN组比较，P＜0.05；c：与穿心莲
          最后进行苏木精和伊红染色，以中性树胶封片，利用光                            内酯低剂量组比较，P＜0.05；d：与穿心莲内酯高剂量组比较，P＜0.05。
          学显微镜观察坐骨神经病理变化并拍照。                                  3.2 穿心莲内酯对大鼠机械痛阈值、热痛阈值的影响
          2.7 大鼠坐骨神经中SOD活性及MDA含量检测                                与对照组比较，DPN 组大鼠机械痛阈值显著降低，
              取“2.5”项下坐骨神经组织，匀浆后在离心半径为                        热痛阈值显著升高（P＜0.05）。与 DPN 组比较，穿心莲
          10 cm 的离心机中以 3 000 r/min 离心 10 min，收集上清             内酯低、高剂量组和硫辛酸组大鼠机械痛阈值均显著升
          液，严格按照试剂盒说明书方法检测大鼠坐骨神经中                             高（P＜0.05），热痛阈值均显著降低（P＜0.05）；rHMGB1
          SOD活性及MDA含量。                                        组大鼠机械痛阈值显著降低（P＜0.05），热痛阈值显著
          2.8 大鼠坐骨神经中HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白                   升高（P＜0.05），且穿心莲内酯的作用具有明显的剂量
          表达检测                                                依赖性（P＜0.05）。与穿心莲内酯高剂量组比较，穿心
              取“2.5”项下坐骨神经，利用 RIPA 裂解缓冲液提取                    莲内酯高剂量+rHMGB1 组大鼠机械痛阈值显著降低
          坐骨神经总蛋白，将蛋白进行定量及高温变性后，电泳                           （P＜0.05），热痛阈值显著升高（P＜0.05）。结果见表1。


          · 574 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 5                               中国药房  2024年第35卷第5期
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