Page 31 - 《中国药房》2024年4期
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2 方法                                               2.5 大鼠血清中炎症因子含量检测
          2.1 KOA模型制备与分组、给药                                      取“2.2”项下各组大鼠的血清样品，严格参照相应试
              将 24 只雄性 SD 大鼠随机分为假手术组、KOA 组、                  剂盒说明书操作，采用 ELISA 法以酶标仪于 450 nm 波
          易层组，每组8只。KOA组和易层组大鼠采取前交叉韧                          长处检测其IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。
          带离断法复制KOA模型：大鼠经腹腔注射30 g/L戊巴比                       2.6 大鼠滑膜组织中纤维化及 HMGB1/TLR4/NF-κB
                                                             信号通路相关蛋白表达检测
          妥钠（2 mL/kg）麻醉，于膝关节处常规备皮消毒，打开膝
                                                                 采用Western blot法检测。取“2.2”项下冻存的各组
          关节腔并切断前交叉韧带（通过前抽屉实验判断模型是
                                                             大鼠滑膜组织适量，研磨、裂解，以 12 000 r/min 离心 15
          否复制成功）后，逐层缝合。假手术组大鼠仅切开膝关
                                                             min，取上清液。经BCA法测定浓度后，加入5×蛋白上
          节处皮肤后缝合。术后，每只大鼠每天肌内注射青霉素
                                                             样缓冲液适量，煮沸变性。取变性蛋白适量，经十二烷
          钠1次，连续3 d，以预防感染。
                                                             基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟
              造模 14 d 后，易层组大鼠于膝关节处备皮，皮肤表
                                                             乙烯膜上，于室温下封闭 20 min；加入内参（GAPDH）、
          面先后均匀涂抹糊状的三色散（每100 cm 涂抹8 g，按成                     纤维化相关蛋白（TGF-β、collagenⅠ、TIMP1、α-SMA）和
                                             2
          品质量计）和复方三黄油膏（每100 cm 涂抹5 g，按成品                     HMGB1/TLR4/NF- κB 信 号 通 路 相 关 蛋 白（HMGB1、
                                          2
          质量计），随后用纱布包裹并用胶带固定，每天贴敷8 h，                        TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65）一抗（稀释比例均为
          连续28 d ；假手术组和KOA组大鼠仅于膝关节备皮处                        1∶1 000），于 4 ℃下孵育过夜；以 TBST 洗膜 10 min×3
                 [6]
          用纱布包裹。                                             次，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），于室温下孵育
          2.2 组织样本的提取和保存                                     60 min；以 TBST 洗膜 10 min×3 次，用 ECL 显色曝光并
              末次给药后，所有大鼠于麻醉状态下采集腹主动脉                         置于凝胶成像发光系统下成像。以 GAPDH 为内参，分
          血，血样静置 1.5 h 后，于 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 15           析并计算各目的蛋白的灰度值比值，用以表示各目的蛋
          min，取上层血清于－80 ℃下冻存，备用。于膝关节处                        白的相对表达量。
          备皮，自髌骨上缘打开关节腔，用眼科镊牵起髌骨及其                           2.7 大鼠滑膜组织中纤维化及 HMGB1/TLR4/NF-κB
          周围组织并翻开，暴露髌下脂肪垫及附着在上面的滑                            信号通路相关蛋白mRNA表达检测
          膜，小心切取滑膜组织。随机选取每组3只大鼠的滑膜                               采用实时聚合酶链式反应（real-time PCR）法检测。
                                                             取“2.2”项下冻存的各组大鼠滑膜组织适量，按照 Trizol
          组织放入 4% 多聚甲醛中保存，其余 5 只大鼠的滑膜组
                                                             法常规提取其总RNA，逆转录后严格按照试剂盒说明书
          织放入冻存管中于－80 ℃下保存，备用。
                                                             操作，进行 PCR 扩增。反应体系包括：上、下游引物各
          2.3 大鼠滑膜组织病理形态学观察
                                                             0.4 μL，cDNA 2 μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，
              取“2.2”项下固定于 4% 多聚甲醛中的各组大鼠滑
                                                             ddH2O 7.2 μL。反应包括预变性阶段（95 ℃，30 s）、循环
          膜组织，行常规石蜡包埋、切片，分别用苏木精-伊红
                                                             反应阶段（95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；共 40 个循环）和熔解
         （HE）、Masson试剂染色后，使用显微镜观察各组大鼠的
                                                             曲线阶段（95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s）。以
          滑膜炎症程度及纤维化程度。采用Krenn评分评价滑膜                                             －ΔΔCt
                                                             GAPDH为内参，采用2           法计算各目的基因mRNA的
          炎症程度，评分标准为：无炎症，记0～1分；有轻度炎症，                        相对表达量（结果以假手术组为参照进行归一化处理）。
                                       [8]
          记2～4分；有重度炎症，记5～9分 。                                各目的基因的引物序列及产物大小见表1。
          2.4 大鼠滑膜组织中 collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB                      表1 各目的基因的引物序列及产物大小
          p65蛋白阳性表达检测                                         目的基因        序列（5′→3′）                 产物大小/bp
              采用免疫组化法检测。取“2.3”项下各组大鼠滑膜                        GAPDH       上游：GCCTTCCGTGTTCCTACC       100
                                                                          下游：CCTGCTTCACCACCTTCTT
          组织的石蜡切片，脱蜡至水，并进行抗原修复；以磷酸盐
                                                              TGF-β       上游：GCAACAATTCCTGGCGTTA      117
          缓冲液（PBS）清洗 5 min×3 次，加入 30 g/L 的过氧化氢                            下游：TTCCGTCTCCTTGGTTCAG
          溶液适量，于室温下孵育 20 min；以 PBS 清洗 5 min×3                 collagen Ⅰ  上游：CGGCTCCTGCTCCTCTT        117
                                                                          下游：AGGTTTCCACGTCTCACCA
          次，以封闭液于室温下封闭 30 min；弃去封闭液，滴加
                                                              TIMP1       上游：CAACCCACCCACAGACA        143
          collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65 一抗（稀释比例均为                           下游：CACAGCGTCGAATCCTTT
          1∶100），于4 ℃下孵育过夜；以PBS清洗5 min×3次，滴                   α-SMA       上游：GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC  150
                                                                          下游：CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC
          加相应二抗（稀释比例1∶500），于室温下孵育60 min；以                     HMGB1       上游：GAGAAGCTGGCTGTAATGC      155
          PBS 清洗 5 min×3 次，以 DAB 复染细胞核，再经脱水后                              下游：GGGACAAACCACAATATAGGA
          封片，使用 Image J 软件分析阳性表达细胞（呈棕色）的                      TLR4        上游：GCCACCATTTACAGTTCGT      125
                                                                          下游：GTCTCAGGCAGGAAAGGA
          平均光密度值，并计算阳性表达细胞面积占比以表示上                            NF-κB p65   上游：TTCCTGGGGAGAGAAGCA       114
          述蛋白的相对表达量。                                                      下游：GGTGAGGTGGGTCTTTGG


          中国药房  2024年第35卷第4期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 4    · 409 ·
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