Page 25 - 《中国药房》2024年4期

集细胞，使用磷酸盐缓冲液洗涤2次，离心，收集细胞沉 沿着打开的肋骨使用扩胸器扩宽，找到心脏并剥离心包
淀，每管加入 100 μL ROS 检测染色液，以 37 ℃培养 30 膜，从左心耳边缘进针、肺动脉圆锥处下1 mm出针进行
min 后离心，收集细胞；使用磷酸盐缓冲液洗涤细胞 3 结扎，使用缝合线快速缝合胸腔和皮肤，并再次消毒，等
[6]
次，再用200 μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，使用流式细胞 大鼠恢复自主呼吸后关闭呼吸机电源，放于笼内饲养 。
仪进行ROS荧光强度定量检测。荧光强度值越大，表明 2.2.2 大鼠血清中心肌损伤和抗氧化指标的检测
细胞中产生的ROS越多。 造模 24 h 后，从大鼠颈总动脉采集血液，以 10 000
2.1.4 H9c2心肌细胞MMP的检测 r/min离心10 min，收集血清，按试剂盒说明书操作，检测
将细胞接种至无菌 6 孔板中，于 37 ℃培养箱中培 各组大鼠血清中LDH、MDA、CK-MB和SOD的含量。
养。将细胞按照“2.1.2”项下方法分组处理后，用无血清 2.2.3 大鼠血清中线粒体指标的检测
DMEM/F12洗涤3次，常规胰酶消化，收集细胞，加入用 取“2.2.2”项下大鼠血清，按试剂盒说明书操作，检
二甲基亚砜配制的 JC-1（10 µg/mL）探针，在 37 ℃恒温 测各组大鼠血清中 complex Ⅰ、complex Ⅳ和 ATP 的
孵箱中孵育 20 min，再用无血清 DMEM/F12 洗涤 3 次， 含量。
用500 μL无血清DMEM/F12重悬，避光送检，进行流式 2.3 统计学分析
细胞仪检测。在健康线粒体中，JC-1 在基质中发生聚 采用 Graph Pad Prism 5.0 和 SPSS 22.0 软件进行统
合，形成明显的红色荧光，而受损的线粒体会随着膜电 计分析。数据以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，
位的降低而丢失，并产生绿色荧光。通过荧光颜色可观 组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
察 MMP 的变化，红/绿色荧光强度比值减小，说明细胞 3 结果
MMP下降。 3.1 槲皮素对H9c2心肌细胞中ROS的影响

2.1.5 H9c2心肌细胞MPTP开放程度的检测 与空白组比较，模型组细胞中ROS荧光强度显著升
按“2.1.3”项下方法处理并收集细胞后，加入200 μL 高（P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素高、中、低剂量组和
荧光淬灭工作液，混匀，在 37 ℃细胞培养箱中培养 30 阳性对照组细胞中 ROS 荧光强度均显著降低（P＜
min后，以1 500 r/min离心5 min，收集细胞，使用磷酸盐 0.01）。结果见图1和图2。
缓冲液洗涤 2 次，再用 200 μL 磷酸盐缓冲液重悬细胞， 400
200
使用流式细胞仪进行 MPTP 荧光强度定量检测。绿色
荧光越强则说明开放程度越低，绿色荧光越弱则说明开 Count 100 Count 200
放程度越高。
2.1.6 H9c2心肌细胞上清液中生化指标的检测
0 0
按“2.1.3”项下方法处理并收集细胞上清液后，采用 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7
DCFH FITC-A DCFH FITC-A
双抗体夹心法测定 ATP 含量，采用硫代巴比妥酸法 A.空白组 B.模型组
200
（TBA法）测定MDA含量，依据酶促反应原理测定LDH
含量，采用微量酶标法测定CK含量，具体步骤均按照试 50
剂盒说明书操作。 Count 100 Count
2.2 动物实验
2.2.1 大鼠分组与造模 0 0
10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7
按照前期实验结果设置给药剂量。大鼠随机分为 DCFH FITC-A DCFH FITC-A
C.槲皮素高剂量组 D.槲皮素中剂量组
假手术组，模型组，槲皮素高、中、低剂量组（100、50、25
200
mg/kg）和阳性对照组（曲美他嗪 6.3 mg/kg），每组 8 只。
大鼠适应性喂养 7 d 后，按体重每 100 g 灌胃相应药物 1 100
mL，每天 1 次，连续 7 d。大鼠末次给药 2 h 后结扎冠状 Count 100 Count
动脉左前降支复制急性心肌缺血模型：麻醉大鼠，固定
背部，连接呼吸机辅助呼吸，设置呼吸频率每分钟 60 0 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 0 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7
DCFH FITC-A
DCFH FITC-A
次，呼吸比1∶1，潮气量3 mL/kg。大鼠胸部去毛消毒后， E.槲皮素低剂量组 F.阳性对照组
沿着心脏方向剪开皮肤，用止血钳分离肌肉，打开肋骨， 图1 各组细胞中ROS的流式细胞图

中国药房 2024年第35卷第4期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 4 · 403 ·