Page 42 - 《中国药房》2024年3期
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2.1.2 胰岛β细胞中GPX4、COX2蛋白表达的检测                        入适量生理盐水置于冰上剪碎并匀浆，以2 500 r/min离
              采用 Western blot 法进行检测。将细胞分为正常对                  心 10 min，取上清液，根据相应试剂盒说明书方法操作，
          照组（只加细胞不加药）、模型组（D-无水葡萄糖，25                          检测小鼠胰腺组织中铁含量。
          mmol/L）、1，8-桉叶油素组（0.5 μmol/L）、Erastin 组（20          2.2.5 小鼠胰腺组织中GPX4、COX2蛋白表达的检测
          μmol/L）、Ferrostatin-1 组（20 μmol/L）、1，8-桉叶油素+            采用 Western blot 法进行检测。取“2.2.2”项下冻存
          Erastin 组（0.5 μmol/L 1，8-桉叶油素+20 μmol/L Eras‐       的胰腺组织（约 10 mg），添加预冷的蛋白裂解液（含 1%
          tin）、1，8-桉叶油素+Ferrostatin-1 组（0.5 μmol/L 1，8-桉      PMSF）于冰上剪碎，裂解30 min，超声处理2 s×5次；于
          叶油素+20 μmol/L Ferrostatin-1），各给药组剂量参考本              4 ℃条件下以 12 000 r/min 离心 20 min，取上清液，然后
          课题组的前期研究         [10―11] 。各组均先加入相应药物预处              按“2.1.2”项下方法检测小鼠胰腺组织中 GPX4、COX2
          理1 h后，再以25 mmol/L D-无水葡萄糖干预72 h。收集                  蛋白表达水平。
          细胞，提取总蛋白，采用 BCA 蛋白定量法测定蛋白浓                          2.3 统计学方法
          度，蛋白经煮沸变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰                                采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，数据
          胺凝胶电泳和转膜，以5%牛血清白蛋白溶液封闭后，分
                                                              以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
          别 加 入 一 抗（GPX4、COX2 的 稀 释 度 均 为 1∶2  000，
                                                              两比较采用LSD-t。检验水准α＝0.05。
          β-actin 的稀释度为 1∶10 000），于 4 ℃孵育过夜；加入相
                                                              3 结果
          应二抗（稀释度为 1∶10 000），室温孵育 2 h；洗膜后，以
                                                              3.1 细胞实验结果
          ECL 化学发光试剂进行显色，置于凝胶成像系统成像，
                                                                                               2+
                                                              3.1.1 1，8-桉叶油素对胰岛β细胞中Fe 水平的影响
          再以 Image-Lab 软件进行分析，以目的蛋白与 β-actin 的
                                                                  与正常对照组（21.12±3.60）比较，模型组（50.07±
          灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
                                                                           2+
                                                              0.49）细胞中 Fe 水平显著升高（P＜0.05），甘露醇组
          2.2 动物实验
                                                                                  2+
                                                             （24.43±2.92）细胞中 Fe 水平变化差异无统计学意义
          2.2.1 分组、造模与给药
                                                             （P＞0.05）。与模型组比较，1，8-桉叶油素低、高剂量组
              小鼠适应性饲养 1 周后，随机选取 20 只，分为正常
                                                             （分 别 为 30.04±2.97、16.51±1.70）以 及 维 生 素 E 组
          对照组和 1，8-桉叶油素毒性研究组（200 mg/kg），每组
                                                                                   2+
                                                             （22.56±3.52）细胞中 Fe 水平均显著降低（P＜0.05）。
          10 只，然后给予普通饲料饲养。另取 40 只小鼠给予高
                                                              结果见图1。
          糖高脂饲料饲养2个月，形成胰岛素抵抗后，采用小剂量
          多次注射的方式，对小鼠腹腔注射链脲佐菌素（35
          mg/kg），隔天注射1次，一共注射4次。第4次注射结束
          1周后检测小鼠空腹血糖，当小鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L
                                            [12]
          时，表明 2 型糖尿病模型小鼠造模成功 。将造模成功
          的小鼠随机分为模型组，1，8-桉叶油素低、高剂量组
                                                                                  25 μm                   25 μm
         （50、200 mg/kg，剂量参考文献[13]设置）、维生素 E 组
                                                                     A.正常对照组                  B.甘露醇组
         （17.5 mg/kg，根据人与动物的等效剂量换算而得），每组
          10只。正常对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，
          各给药组小鼠灌胃相应药物，每天1次，连续8周。
          2.2.2 小鼠空腹血糖检测及取材
              末次给药后，小鼠禁食不禁水12 h后检测各组小鼠
                                                                                  25 μm                   25 μm
          空腹血糖；然后处死小鼠，分离其胰腺组织，部分置于4%
          多聚甲醛溶液中固定，另一部分置于液氮中冻存备用。                                    C.模型组               D. 1，8-桉叶油素低剂量组
          2.2.3 小鼠胰腺组织病理形态学观察
              取“2.2.2”项下固定于4%多聚甲醛的小鼠胰腺组织
          适量，经石蜡包埋、切片、梯度脱水等处理后，进行苏木
          精-伊红（HE）染色以及糖原沉积染色，采用显微镜进行
          观察，并拍照。                                                                 25 μm                   25 μm
          2.2.4 小鼠胰腺组织中铁含量的检测                                     E. 1，8-桉叶油素高剂量组            F.维生素E组
                                                                                           2+
              取“2.2.2”项下冻存的小鼠胰腺组织（约 10 mg），加                       图1 各组胰岛β细胞中Fe 的荧光显微图

          · 292 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 3                               中国药房  2024年第35卷第3期
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