Page 65 - 《中国药房》2024年1期
P. 65

建模方法如下：连续21 d每天灌胃1次来曲唑混悬液（来                        2.8 大鼠卵巢组织中 HMGB1/RAGE 信号通路相关蛋
          曲唑溶于 1% 羧甲基纤维素钠溶液），灌胃剂量为 1                         白表达量的检测
                                  [7]
          mg/kg，灌胃体积为10 mL/kg 。空白组大鼠连续21 d按                      采用Western blot法检测。取冻存于－80 ℃冰箱中
          10 mL/kg的体积灌胃1%羧甲基纤维素钠溶液。造模第                       的卵巢组织，用 RIPA 裂解缓冲液裂解并提取组织中总
          16天时进行阴道涂片检测，若观察到阴道上皮细胞持续                          蛋白，用BCA法对蛋白质定量，然后将蛋白进行高温变
                               [7]
          角化，即为模型构建成功 。建模成功后，茯苓酸低、高                          性。取30 μg变性蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯
                                                 [8]
          剂量组大鼠分别灌胃8.33、33.32 mg/kg茯苓酸 ，炔雌醇                  酰胺凝胶电泳（电压 100 V，电泳时间 1 h）分离，然后以
                                                     [9]
          环丙孕酮组大鼠灌胃 0.34 mg/kg 炔雌醇环丙孕酮 ，且                    湿转法转移（电流 200 mA，转膜时间 2 h）至聚偏氟乙烯
          均需尾静脉注射等体积的生理盐水；rHMGB1组大鼠尾                         膜上，以 5% 脱脂牛奶封闭 1 h；将膜与一抗 HMGB1（稀
                                 [10]
          静脉注射 8 μg/kg rHMGB1 且还需灌胃等体积的生理                    释比例 1∶3 000）、RAGE（稀释比例 1∶4 000）、p-NF-κB
          盐水；茯苓酸高剂量+rHMGB1 组大鼠灌胃 33.32 mg/kg                 p65（稀释比例1∶5 000）、NF-κB p65（稀释比例1∶5 000）、
          茯苓酸且还需尾静脉注射 8 μg/kg rHMGB1；空白组、                    GAPDH（稀释比例1∶5 000）在4 °C下孵育过夜，再与二
                                                             抗（稀释比例1∶3 000）在常温下共同孵育1 h。加入ECL
          PCOS 组大鼠均需尾静脉注射且灌胃等体积的生理盐
                                                             试剂观察蛋白印迹，利用Image J软件评估蛋白灰度值。
          水。每天给药1次，持续4周。
                                                             以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）灰度值的比值作为目
          2.2 标本收集及处理
                                                             的蛋白表达量，其中 p-NF-κB p65 蛋白表达量用 p-NF-
              末次给药24 h后，麻醉大鼠，收集大鼠空腹8 h的腹
                                                             κB p65与NF-κB p65的灰度值比值确定。
          主动脉血，经离心（3 000 r/min，10 min）得血清，保存
                                                             2.9 统计学方法
          于－80 ℃冰箱中备用。取血完成后，在每组 18 只大鼠
                                                                 采用 SPSS 25.0 软件进行统计分析，符合正态分布
          中随机选取6只，称定体重，然后处死大鼠，收集其卵巢，
                                                             且方差齐性的计量资料以 x±s 表示。多组间比较采用
          用滤纸吸去卵巢表面液体后称量卵巢质量，用于卵巢系
                                                             单因素方差分析，进一步两组间的比较采用 SNK-q 检
          数的计算。将各组剩余的 12 只大鼠处死，收集卵巢组
                                                             验。检验水准α＝0.05。
          织，分为两部分（每部分包含6只大鼠的卵巢组织），一部
                                                             3 结果
          分组织固定于4%多聚甲醛中用于HE染色，另一部分组
                                                             3.1  茯 苓 酸 对 大 鼠 空 腹 血 糖 、空 腹 胰 岛 素 水 平 及
          织 冻 存 于 －80  ℃ 冰 箱 中 用 于 ELISA 和 Western  blot
                                                             HOMA-IR的影响
          检测。
                                                                 与空白组比较，PCOS组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素
          2.3 大鼠空腹血糖、空腹胰岛素水平及胰岛素抵抗指数
                                                             水平及HOMA-IR显著升高（P＜0.05）；与PCOS组比较，
          的检测
                                                             茯苓酸低、高剂量组和炔雌醇环丙孕酮组大鼠空腹血
              取“2.2”项下血清，用血糖仪检测大鼠空腹血糖；采
                                                             糖、空腹胰岛素水平及 HOMA-IR 显著降低（P＜0.05），
          用ELISA法检测大鼠空腹胰岛素水平，并计算胰岛素抵
                                                             而 rHMGB1 组 大 鼠 空 腹 血 糖 、空 腹 胰 岛 素 水 平 及
          抗 指 数（insulin  resistance  index，HOMA-IR）：HOMA-    HOMA-IR 显著升高（P＜0.05）；与茯苓酸高剂量组比
          IR＝空腹血糖水平×空腹胰岛素水平/22.5。                            较，茯苓酸高剂量+rHMGB1组大鼠空腹血糖、空腹胰岛
          2.4 大鼠血清中FSH、LH、T水平的检测                             素水平及HOMA-IR显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
              取“2.2”项下血清，严格按照相应 ELISA 试剂盒说                   表1 各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素水平及 HOMA-
          明书操作，检测大鼠血清中FSH、LH、T水平。                                 IR比较（x±s，n＝18）
          2.5 大鼠卵巢系数的检测                                       组别             空腹血糖/（mmol/L）  空腹胰岛素/（mU/L）  HOMA-IR
              统计各组大鼠体重及卵巢质量，并计算卵巢系数，                          空白组              5.12±0.22   70.36±2.96  16.01±0.07
                                                              PCOS组            7.95±0.31 a  126.68±5.77 a  44.76±1.98 a
          通过卵巢系数来评估卵巢病变程度。卵巢系数＝卵巢
                                                              茯苓酸低剂量组          7.04±0.32 b  109.84±3.69 b  34.37±1.67 b
          质量（g）/体重（g）。                                        茯苓酸高剂量组          5.59±0.23 b  87.86±2.76 b  21.83±1.05 b
          2.6 大鼠卵巢组织病理变化观察                                    炔雌醇环丙孕酮组         5.61±0.24 b  87.91±2.81 b  21.92±1.08 b
                                                              rHMGB1组          8.43±0.30 b  145.52±5.06 b  54.52±2.36 b
              将“2.2”项下在4%多聚甲醛中固定24 h的卵巢组织
                                                              茯苓酸高剂量+rHMGB1组   6.43±0.29 c  95.57±3.15 c  27.31±1.28 c
          取出，经常规脱水、石蜡包埋后制成 4 µm 厚的切片，常                          a：与空白组比较，P＜0.05；b：与PCOS组比较，P＜0.05；c：与茯苓
          规HE染色，然后用光学显微镜观察卵巢组织病理变化。                          酸高剂量组比较，P＜0.05。
          2.7 大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α水平的检测                        3.2 茯苓酸对大鼠血清中FSH、LH、T水平的影响
              取“2.2”项下冻存于－80 ℃冰箱中的卵巢组织，匀                         与空白组比较，PCOS 组大鼠血清中 FSH 水平显著
          浆后严格按照相应ELISA试剂盒说明书方法操作，检测                         降低（P＜0.05），LH、T 水平显著升高（P＜0.05）。与
          大鼠卵巢组织中IL-1β、TNF-α水平。                              PCOS组比较，茯苓酸低、高剂量组和炔雌醇环丙孕酮组


          中国药房  2024年第35卷第1期                                                  China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 1    · 59 ·
   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70