Page 51 - 《中国药房》2023年24期
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logicals 公司；兔 IL-6 多克隆抗体（批号 DF6087）购自美             右后肢足跖厚度。测量结束后，以 1% 戊巴比妥钠麻醉
          国Affinity公司；兔肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（peptidylar‐               大鼠，取其腹主动脉血，静置后以 3 000 r/min 离心 15
          ginine deiminase 4，PAD4）单克隆抗体（批号 ab214810）         min，收集上层血清，于－80 ℃下保存，备测。取血后，
          购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊                       处死各组大鼠，快速收集其左后肢踝关节组织，以4%多
          抗兔 IgG 二抗（批号 A0208）购自碧云天生物技术有限                     聚甲醛固定，右后肢踝关节于－80 ℃下保存，备测；取大
          公司。                                                鼠心脏组织，横切一分为二，上部于－80 ℃下保存，下部
          1.3 实验动物                                           以4%多聚甲醛固定，备测；取大鼠腹主动脉组织，以4%
              本研究所用实验动物为 8 周龄的 SPF 级雌性 SD 大                  多聚甲醛固定，备测。
          鼠（70只），体重为（200±10）g。所有动物均购自并饲养                     2.4 大鼠踝关节、心脏及腹主动脉组织的病理学观察
          于贵州中医药大学实验动物研究所，动物生产许可证号                               采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法观
          为 SCXK（黔）2021-0003。本实验方案经贵州中医药大                    察。取“2.3”项下每组5只大鼠以4%多聚甲醛固定的踝
          学实验动物伦理审查委员会批准，编号为20210100。                        关节组织适量，脱钙后依次以 75%、85%、95%、100% 乙
          2 方法                                               醇梯度脱水，经石蜡包埋后切片，再依次用苏木精、伊红

          2.1 飞龙掌血药液的制备                                      染色，经二甲苯透明后，以中性树胶封片，使用显微镜对
              取飞龙掌血药材，共 3 份，分别以 8 倍水浸泡 0.5 h                 其踝关节进行组织形态学观察及图像采集。
          后，煎煮 30 min×2 次；合并提取液，过滤，浓缩，得质量                        取“2.3”项下每组5只大鼠以4%多聚甲醛固定的心
          浓度分别为 0.054、0.108、0.216 g/mL（以生药量计）的药              脏和腹主动脉组织各适量，按前述方法脱水、包埋、切
          液，备用。                                              片、染色、透明后封片，使用显微镜对其心脏及腹主动脉
          2.2 分组、造模与给药                                       进行组织形态学观察及图像采集。
              将大鼠随机分为正常组（9只）和造模组（61只）。取                      2.5 大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量检测
                               [15]
          造模组大鼠，按如下方法 造模：将牛Ⅱ型胶原用乙酸                               采用 ELISA 法检测。随机选取每组 5 只大鼠冻存
          溶解制成胶原溶液（2 mg/mL）后，与弗氏不完全佐剂等                       的血清样本，按照相应试剂盒说明书方法操作，使用酶
          体积混合，制得胶原乳液。于实验第0天在大鼠背部、尾                          标仪检测其血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量。
          根部和双足进行多点注射（每处 0.1 mL），即初次免疫；                      2.6 大鼠心脏组织中PAD4、VDR蛋白表达水平检测
          于第 7 天在其背部、尾根部不同部位再次注射（每处 0.1                          采用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）法
          mL），即二次免疫。于造模后（第 8 天）随机选择数只大                       检测。取“2.4”项下每组3只大鼠的心脏组织切片，经枸
          鼠进行关节炎指数评分——无皮肤发红和关节肿胀症                            橼酸抗原修复溶液孵育 15 min 后，以山羊血清封闭，滴
          状，记 0 分；脚踝或足部轻微发红、肿胀，记 1 分；脚踝和                     加 PAD4、VDR 一抗（稀释比例均为 1∶100），于 4 ℃下孵
          足部均轻微发红、肿胀，记2分；脚踝和跖骨关节中度发                          育过夜；用磷酸盐缓冲液清洗3次后，加入相应二抗，室
          红、肿胀，记3分；全足严重发红、肿胀，记4分；尾部红斑                        温孵育 30 min；再次清洗后，以 DAB 显色液显色，再以
          和前肢肿胀各记 0.5 分；总分为 5 分，评分大于 4 分则判                   Mayer’s 苏木精复染，经乙醇梯度脱水后，以二甲苯透
                             [16]
          定为CIA模型复制成功 。                                      明，风干后封片，使用显微镜进行观察。采用Image-Pro
              将造模成功的54只大鼠随机分为模型组，甲氨蝶呤                        Plus 6.0 软件对 IHC 图进行光密度分析，计算阳性区域
          组（阳性对照，1.5 mg/kg，每周2次，剂量参考相关文献               [17]  （即黄褐色或棕褐色区域）的平均光密度用以表示
          设置），VD组[通路验证，1 000单位/（kg·d），每天1次，剂                 PAD4、VDR蛋白的表达水平。
                         [18]
          量参考相关文献 设置]，飞龙掌血低、中、高剂量组                           2.7 大鼠心脏组织中 CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1 蛋
          [0.54、1.08、2.16 g/（kg·d），以生药量计，每天 1 次，剂量           白表达水平检测
          参考成人临床常用剂量并根据大鼠体表面积折算而得，                               采用 Western blot 法检测。取“2.3”项下每组 3 只大
          中剂量为临床等效剂量]，每组9只。各药物组大鼠灌胃                          鼠的冻存心脏组织，解冻后剪取适量，用含 PMSF 的裂
          相应药液，正常组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水                            解液匀浆后，于冰上裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min
         （每天1次），连续4周。                                        离心5 min，取上清液，使用BCA法测定蛋白浓度并作变
          2.3 大鼠足跖肿胀情况观察及取材                                  性处理。取变性蛋白适量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳
              造模后，于给药前对各组大鼠进行关节炎指数评                         （电压依次为 80、120 V）分离并转膜（电流为 200 mA），
          分，并分别于给药前和末次给药后用游标卡尺测量大鼠                           用 脱 脂 奶 粉 封 闭 ；洗 膜 后 ，加 入 CitH3、MPO、IL-6、


          中国药房  2023年第34卷第24期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 24    · 2989 ·
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