Page 52 - 《中国药房》2023年20期
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3×10  cfu/mL（cfu即菌落形成单位），取20 μL注入大鼠                 蜡包埋后切片（厚度 3～5 μm），再经苏木精-伊红染色、
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          阴道，每天1次，持续6 d。每天观察大鼠阴道口外观，当                         脱水透明后，以中性树脂封片，使用光学显微镜观察其
          出现明显充血红肿，伴有大量白色黏性分泌物，且分泌                            阴道组织病理改变。
          物检查结果示菌株生长旺盛，即表明大鼠阴道环境已被                            2.2.6 大鼠阴道组织中 TLR2、TLR4、NF-κB 蛋白表达
                              [12]
          破坏，BV模型复制成功 。                                       检测
              参考百草妇炎清栓的成人日剂量（4 g），经人与大鼠                          （1）免疫组化实验：取“2.2.5”项下正常组、模型组、
          给药剂量换算后确定其低、中、高剂量组的剂量分别为                            百草妇炎清栓中剂量组大鼠（每组 8 只）的阴道组织切
          0.18、0.36、0.72 g/kg（对应给药体积分别为 0.16、0.32、            片，每 10 min 用二甲苯清洗 1 次（共 4 次），再依次用
          0.64 mL/kg），栓剂于37 ℃水浴中静置，至流体状态后使                    100%、95%、85%、75% 乙腈梯度脱水 2 min，用水清洗并
          用注射器经阴道给药；甲硝唑阴道泡腾片的成人日剂量                            浸泡 5 min；用乙二胺四乙酸修复 15 min 后，用水冲洗；
          为0.4 g，经人与大鼠给药剂量换算后确定其剂量为0.03                       滴加山羊血清封闭液（以磷酸盐缓冲液稀释），室温孵
          g/kg，直接经阴道给药；正常组和模型组大鼠经阴道给予                         育 60 min；滴加 TLR2、TLR4、NF-κB 一抗（稀释比例均
          生理盐水0.32 mL/kg，每天1次，持续6 d。                          为 1∶100），于 4 ℃下孵育过夜；用磷酸盐缓冲液冲洗 3
          2.2 指标检测                                            min×3次后，滴加相应二抗（稀释比例为1∶200），于室温
          2.2.1 大鼠阴道外观评分                                      下孵育 30 min；用磷酸盐缓冲液冲洗 3 min×3 次后，以
              参考李福元等 建立的阴道外观评分标准（表 1），                        DAB显色；用水冲洗后，以苏木精复染1～5 min；用水冲
                          [13]
          于末次给药 24 h 后对各组大鼠阴道口红肿情况和分泌                         洗，固片；随机选取3个视野，使用显微镜观察上述蛋白
          物情况进行评分，所得评分越高，表明大鼠的阴道炎症                            的阳性表达情况（以黄色或棕黄色为阳性表达），并使用
          越严重。                                                Image J软件分析阳性表达的平均光密度值，以反映各蛋
                     表1 大鼠阴道外观评分标准                            白的表达水平。
           评价指标                   评价标准             评分            （2）Western blot 实验：取“2.2.5”项下正常组、模型
           阴道口红肿情况            阴道口褶皱紧致，无红肿外翻         0         组、百草妇炎清栓中剂量组大鼠（每组4只）冻存的阴道
                              阴道口稍扩大，红肿不明显          1
                              阴道口明显扩大，有红肿外翻         2         组织样品，加入RIPA裂解缓冲液适量，于冰浴中裂解30
                              阴道口明显扩大，红肿外翻严重        3         min，以6 000 r/min匀浆10 min，再以12 000 r/min于4 ℃
           阴道分泌物情况            阴道口干燥，无明显分泌物          0         下离心 15 min，取上清液，用 BCA 法测定蛋白浓度并作
                              阴道口稍湿润，无明显分泌物流出       1
                              阴道口湿润，有液体分泌物流出        2         变性处理。取变性后的蛋白样品 40 μg，经 10% 十二烷
                              阴道口湿润，有固体分泌物粘连        3         基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后以湿转法转移至
          2.2.2 大鼠阴道pH检测                                      聚偏氟乙烯膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭 2 h；加入 TLR2、
              末次给药24 h后，将pH试纸插入大鼠阴道口，待与                       TLR4、NF-κB、GAPDH 一抗（稀释比例分别为 1∶1 000、
          阴道分泌物充分接触后迅速取出，与标准比色卡比对并                            1∶1 000、1∶2 000、1∶6 000），于4 ℃下孵育过夜；用TBST
          记录其阴道pH。                                            缓冲液清洗，加入相应二抗（稀释比例均为1∶6 000），于
          2.2.3 大鼠阴道灌洗液中细胞因子检测                                37 ℃下孵育1 h；以ECL化学发光法显影后，于成像系统
              测完 pH 后，所有大鼠均禁食、禁水过夜。次日，用                       下成像。使用 Image J 软件进行分析，以目的蛋白与内
          生理盐水 100 μL 清洗大鼠阴道 3 次，收集阴道灌洗液                      参蛋白（GAPDH）的灰度值比值作为目的蛋白的相对表
          于－80 ℃保存，备用。取上述灌洗液，于室温（24±2）℃                       达量。
          下放置30 min，在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，吸取              2.3 统计学方法
          上清液，采用双抗体夹心法以酶标仪检测其IL-1β、IL-2、                          使用 SPSS 23.0 和 GraphPad Prism 8.0 软件对数据
          IL-13、IgA水平，严格按照相应试剂盒说明书方法操作。                       进行统计分析和可视化展示。数据均以x±s表示，多组
          2.2.4 大鼠子宫及附件形态观察                                   间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t
              收集完阴道灌洗液后，所有大鼠用 2% 戊巴比妥钠                        检验。检验水准α＝0.05。
         （腹腔注射）麻醉，剖开腹腔，取出子宫及附件，进行形态                           3 结果
          观察并拍照。                                              3.1 百草妇炎清栓对BV大鼠阴道外观评分的影响
          2.2.5 大鼠阴道组织病理学观察                                       与正常组比较，模型组大鼠的阴道口红肿评分和分
              取各组大鼠阴道组织，部分组织置于 4 ℃的 4% 多                      泌物评分均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，各药
          聚甲醛中固定，剩余组织于－80 ℃下冻存，备用。取上                          物组大鼠上述评分均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。
          述固定于多聚甲醛中的大鼠阴道组织，经脱水、常规石                            结果见表2。


          · 2478 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 20                            中国药房  2023年第34卷第20期
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