Page 30 - 《中国药房》2023年20期

中，设空白组、H2O2组和芒果苷 50、100、150 μmol/L 组， 表1 芒果苷对 H9c2 细胞相对存活率和氧化应激指标
每组设 3 个复孔。各组细胞按“2.2”项下方法处理。收 的影响（x±s）
集细胞，加入RIPA裂解液，提取总蛋白。测定蛋白浓度 相对存活率 SOD（n＝4）/ CAT（n＝4）/ MDA（n＝4）/
组别 ROS（n＝4）
后，加入 5×蛋白上样缓冲液，并在 100 ℃下煮沸 5 min （n＝3）/% （U/mg） （U/mg） （nmol/mg）
变性。取变性后的蛋白样品适量，经十二烷基硫酸钠- 空白组 100.00±0.03 30.21±1.33 33.04±2.15 8.51±1.20 1.00±0.03
H 2O 2组 50.12±0.53 a 14.07±0.87 b 12.10±1.38 b 24.32±4.39 b 4.55±0.40 b
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜、封闭；洗膜后，分别加
芒果苷50 μmol/L组 53.17±1.13 17.21±1.02 15.03±1.92 20.08±2.15 4.14±0.22
入 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、NFATc4、tubulin、lamin 芒果苷100 μmol/L组 79.08±1.03 c 20.05±1.14 c 21.17±2.05 c 18.54±1.97 c 3.03±0.22 c
B1一抗（稀释度均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜 芒果苷150 μmol/L组 94.67±0.87 c 23.07±1.29 c 25.78±3.01 c 14.07±2.01 c 1.97±0.17 c
后，加入相应二抗（稀释度均为1∶5 000），于室温下孵育 a：与空白组比较，P＜0.05；b：与空白组比较，P＜0.01；c：与H 2O 2组
1 h；洗膜后，以ECL发光液显色并使用凝胶电泳成像分 比较，P＜0.05。
析系统成像。采用 GraphPad Prism 5.0 软件计算 Bcl-2、 3.3 芒 果 苷 对 H9c2 细 胞 凋 亡 相 关 蛋 白 和 核 蛋 白
Bax、cleaved caspase-3与内参tubulin以及核蛋白NFATc4 NFATc4表达的影响
与内参lamin B1的灰度值比值，用以表示上述蛋白的相 与空白组比较，H2O2组细胞中 Bcl-2 的相对表达量
对表达量（结果以空白组为标准作归一化处理）。 显著降低，Bax、cleaved caspase-3和核蛋白NFATc4的相
2.6 NFATc4 对 H9c2 细胞氧化应激及凋亡相关指标的
对表达量均显著升高（P＜0.05）。与 H2O2组比较，芒果
影响检测 苷100、150 μmol/L组细胞中Bcl-2的相对表达量均显著
本研究通过干扰 NFATc4 蛋白的表达并检测 H9c2
细胞中氧化应激指标和凋亡相关蛋白的变化来评价 升高，Bax、cleaved caspase-3和核蛋白NFATc4的相对表
NFATc4 蛋白对上述指标的影响。NFATc4 干扰序列由 达量均显著降低（P＜0.05）。结果见图1、表2。
上海吉玛制药技术有限公司设计，上、下游序列分别为
5′-GGAGUCUGAACUUAAUGAATT-3′、5′-UUCAUU- Bcl-2 28 kDa
AAGUUCAGACUCCTT-3′。取对数生长期的细胞，设
Bax 20 kDa
空白组、H2O2组、siNFATc4组、H2O2+siNFATc4组，每组设
3 个复孔。参照转染试剂使用说明书，将 Lipo8000 转染 cleaved caspase-3 17 kDa
试剂 4 μL、干扰序列 100 pmol 和无血清无抗生素的
DMEM 培养基 125 μL 混合，加入至 siNFATc4 组、H2O2+ tubulin 55 kDa
siNFATc4组细胞中，再用含2%胎牛血清的DMEM培养 空白组 H 2 O 2 组 芒果苷50 芒果苷100 芒果苷150
基补足至2 mL；其余组不加入干扰序列，处理方法同前。 μmol/L组 μmol/L组 μmol/L组
A.凋亡相关蛋白
各组细胞培养 36 h 后，H2O2组和 H2O2+siNFATc4 组细胞
用 H2O2 （200 μmol/L）刺激 12 h。随后，收集空白组和 NFATc4 140 kDa
siNFATc4 组 细 胞 ，按“2.5”项 下 方 法 检 测 其 核 蛋 白
lamin B1 66 kDa
NFATc4的表达情况，以评价转染效果；收集各组上清液和
细胞，分别按“2.3”～“2.5”项下方法检测 SOD、CAT、 空白组 H 2 O 2 组 芒果苷50 芒果苷100 芒果苷150
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
MDA、ROS水平和Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表 B. 核蛋白NFATc4
达情况，以评价干扰NFATc4蛋白表达对上述指标的影响。 图1 芒 果 苷 对 H9c2 细 胞 凋 亡 相 关 蛋 白 和 核 蛋 白
2.7 统计学方法 NFATc4表达影响的电泳图
采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资 表2 芒 果 苷 对 H9c2 细 胞 凋 亡 相 关 蛋 白 和 核 蛋 白
料以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两 NFATc4表达的影响（x±s，n＝3）
比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
组别 Bcl-2/tubulin Bax/tubulin cleaved caspase-3/tubulin NFATc4/lamin B1
3 结果 空白组 1.00±0.03 1.00±0.04 1.00±0.02 1.00±0.03
3.1 芒果苷对H9c2细胞相对存活率的影响 H 2O 2组 0.31±0.05 a 2.73±0.18 a 2.59±0.19 a 2.67±0.17 a
与空白组比较，H2O2组细胞的相对存活率显著降低 芒果苷50 μmol/L组 0.42±0.11 2.36±0.32 2.28±0.15 2.41±0.32
芒果苷100 μmol/L组 0.75±0.14 b 1.37±0.13 b 1.84±0.17 b 1.55±0.14 b
（P＜0.05）；与H2O2组比较，芒果苷100、150 μmol/L组细
芒果苷150 μmol/L组 0.87±0.09 b 1.18±0.11 b 1.37±0.12 b 1.27±0.19 b
胞的相对存活率均显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
a：与空白组比较，P＜0.05；b：与H 2O 2组比较，P＜0.05。
3.2 芒果苷对H9c2细胞氧化应激指标的影响
与空白组比较，H2O2组细胞的 SOD、CAT 水平均显 3.4 NFATc4 对 H9c2 细胞氧化应激及凋亡相关指标的
著降低，MDA、ROS 水平均显著升高（P＜0.01）。与 影响
H2O2 组比较，芒果苷 100、150 μmol/L 组细胞的 SOD、 3.4.1 细胞核蛋白NFATc4表达的变化
CAT水平均显著升高，MDA、ROS水平均显著降低（P＜ 干扰核蛋白 NFATc4 的表达后，细胞核内该蛋白的
0.05）。结果见表1。 表达显著下调（P＜0.01）。结果见图2。

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