Page 29 - 《中国药房》2023年20期
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衰竭患者和心力衰竭动物模型中均存在高水平的氧化应                           检测试剂盒（批号分别为A001-1-2、A007-1-1、A003-1-2）
          激，且氧化应激与不良预后密切相关 。氧化应激损伤涉                          均购自南京建成生物工程研究所；兔源 Bcl-2 相关 X 蛋
                                        [2]
          及多方面因素，过氧化物的堆积可直接造成细胞器损伤                           白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、剪切的胱天蛋白酶
          及多种功能紊乱，促进心肌重构和病理性心脏肥大的发                           3（cleaved caspase-3）多克隆抗体（批号分别为 2772S、
          展，并最终引发心力衰竭 。传统天然药物在抗肿瘤等领                          9661S）均购自美国 CST 公司；鼠源 NFATc4 多克隆抗体
                              [3]
          域表现出良好的抗氧化应激作用，然而其在心血管相关                          （批号sc-271597）购自美国Santa Cruz公司；鼠源微管蛋
          疾病中的价值尚有待发掘；同时，在心脏肥大机制和有效                          白（tubulin）单克隆抗体、兔源核纤层蛋白 B1（lamin B1）
          治疗方法研究领域中，揭示氧化应激在心脏肥大发展中                           多克隆抗体（批号分别为T6199、SAB2101352）均购自美
          的作用机制、寻找有效的天然药物等也备受学者关注。                           国Sigma公司。
              芒果苷为双苯吡酮类化合物，主要从芒果叶中提取                         1.3 细胞株
          而得，具有显著的抗氧化、抗炎作用，且因具有良好的成                              大鼠心肌细胞H9c2细胞株购自中国科学院上海生
          药性而被广泛用于改善咳嗽、咳痰等呼吸系统症状                     [4―5] 。  科院细胞资源中心。
          研究指出，芒果苷可通过激活核转录因子红系2相关因                           2 方法
          子 2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗  2.1 细胞培养
          氧化响应元件（antioxidant response element，ARE）通路、            取 H9c2 细胞，复苏后培养于含 10% 胎牛血清的
          促进抗氧化酶表达等途径来改善多种原因造成的氧化                            DMEM培养基中，待融合至80%左右进行传代；将传代
          应 激 损 伤  [6―7] 。 有 研 究 指 出 ，活 化 T 细 胞 核 因 子 c4     后的细胞继续培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基
         （nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 4，NFATc4）  中；待融合至80%左右时，将培养基替换为含2%胎牛血
          是促进心脏肥大的重要转录因子，其被激活后可结合到                           清的DMEM培养基，继续培养。
          心房钠尿肽（atrial natriuretic factor，ANF）、B型利尿钠肽        2.2 细胞相对存活率检测
         （B-type natriuretic peptide，BNP）的启动子上，从而促进              取对数生长期的细胞，按 6×10 个/孔接种于 96 孔
                                                                                            3
                        [8]
          肥大基因的表达 。同时多项研究证实，NFATc4在诱导                        板中，培养过夜。待细胞贴壁后，将其分为空白组、H2O2
          氧化应激和促进细胞凋亡中也具有重要作用 。本研究                           组和芒果苷 50、100、150 μmol/L 组（浓度参考相关文
                                                [9]
          拟以大鼠 H9c2 细胞为对象，以过氧化氢（H2O2 ）为诱导                    献 和本课题组前期预实验结果设置），每组设 3 个复
                                                               [11]
          剂 ，通过检测凋亡相关蛋白、活性氧（reactive oxygen                  孔。各药物组经不同浓度芒果苷作用12 h后，再与H2O2
            [10]
                                                                                                     [12]
          species，ROS）和抗氧化酶活性的变化，探讨芒果苷对                      组一同经H2O2 （200 μmol/L，浓度参考相关文献 和本课
          H2O2 致氧化应激的影响，并初步考察该作用是否与                          题组前期预实验结果设置）刺激 12 h；随后，每孔加入
          NFATc4 有关，以期为证实芒果苷改善氧化应激的潜能                        CCK-8试剂10 μL和DMEM培养基90 μL，继续培养1 h，
          提供依据，为心脏肥大的治疗挖掘新靶点、提供新思路。                          使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（optical
          1 材料                                               density，OD）值，并按下式计算各组细胞的相对存活率：
          1.1 主要仪器                                           相对存活率＝实验组细胞OD值/空白组OD值×100%。
              本研究所用主要仪器包括 3111 型细胞培养箱、                       2.3 细胞上清液中SOD、CAT、MDA水平检测
          Model-450 型酶标仪、Multiskan MK3 型酶标仪（美国                   取对数生长期的细胞，按 5×10 个/孔接种于 96 孔
                                                                                            3
          Thermo Fisher Scientific 公司），Power/Pac300 型稳压稳     板中，设空白组、H2O2 组和芒果苷 50、100、150 μmol/L
          流电泳仪、Trans-Blot SD型转膜仪（美国Bio-Rad公司），               组，每组设 4 个复孔。各组细胞按“2.2”项下方法处理。
          Image Quant 800 型凝胶电泳成像分析系统（美国 Cytiva              收集各组细胞上清液，于 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 10
          公司）等。                                              min，使用酶标仪检测各组细胞上清液中 SOD、CAT、
          1.2 主要药品及试剂                                        MDA的水平。操作过程严格按照试剂盒说明书执行。
              芒果苷原料药（批号20220203，纯度98%）购自南宁                   2.4 细胞ROS水平检测
                                                                                            3
          维康医药科技有限公司；DMEM培养基（批号8122609）                          取对数生长期的细胞，按 5×10 个/孔接种于 96 孔
          购自美国Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清、CCK-           板中，设空白组、H2O2 组和芒果苷 50、100、150 μmol/L
          8 试剂、Lipo8000 转染试剂、ROS 检测试剂盒[含 2，7-二               组，每组设 4 个复孔。各组细胞按“2.2”项下方法处理。
          氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针]、兔源 B 细胞淋巴                     收集细胞，在含 10 μmol/L DCFH-DA 探针的无血清
          瘤 2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）多克隆抗体和辣根过氧             DMEM 培养基中孵育 20 min，用磷酸盐缓冲液清洗 3
          化物酶（HRP）标记的羊抗鼠 IgG 二抗、羊抗兔 IgG 二抗                   次，使用酶标仪于激发波长488 nm、发射波长525 nm下
         （货 号/批 号 分 别 为 C0232、C0041、C0533、S0033S、            检测各孔的荧光强度，用以表示 ROS 水平（结果以空白
          AB112、A0192、A0239）均购自碧云天生物技术有限公                    组为标准作归一化处理）。
          司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧             2.5 细胞凋亡相关蛋白和核蛋白NFATc4表达的检测
                                                                                            4
          化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）             取对数生长期的细胞，按1×10 个/孔接种于6孔板

          中国药房  2023年第34卷第20期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 20    · 2455 ·
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