Page 61 - 《中国药房》2023年17期
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取食物和水。本实验经过广东省妇幼保健院医学伦理                            2.6 小鼠回肠组织中 TLR4、MyD88 mRNA 表达水平
          委 员 会 批 准 ，批 准 号 为 广 东 省 妇 幼 保 健 院 医 伦 第           的检测
          [202001070]号。                                          取“2.3”项下小鼠回肠组织样品适量（每组选取6只
          2 方法                                               小鼠的样品），使用 TRIzol 试剂按照说明书要求提取小
          2.1 实验分组、造模与给药                                     鼠回肠组织总 RNA，使用逆转录试剂盒合成 cDNA，再
              将 60 只 C57BL/6J 小鼠按体重随机分为 6 组，分别               按照荧光实时定量PCR检测试剂盒制备反应体系，反应
          为假手术（Sham）组、假手术+大承气汤高剂量（Sham+                      条件为：95℃ 10 min；95℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 35 s；循
          DCQD-H）组、模型（CLP）组、大承气汤低剂量（DCQD-                    环40个周期。绘制熔解曲线，采用2              －ΔΔCt 法，以actb为内
          L）组、大承气汤高剂量（DCQD-H）组、阳性对照（Posi‐                    参，计算 TLR4、MyD88 mRNA 的表达水平。引物序列
          tive）组，每组10只。CLP组、DCQD-L组、DCQD-H组和                 由广州四和生物科技股份有限公司合成，具体见表1。
          Positive组小鼠均以盲肠结扎穿刺法建立肠源性脓毒症                                 表1 引物序列及扩增产物长度
              [11]
          模型 。DCQD-L组和DCQD-H组在术前3 d和术后7 d                     基因          序列（5′→3′）                 产物长度/bp
                                                              TLR4        上游：ATGGCATGGCTTACACCACC     129
                                                [12]
          每天灌胃给予大承气汤（剂量分别为4、8 g/kg ，按生药                                   下游：GAGGCCAATTTTGTCTCCACA
          量计）；Positive 组在术前 2 h 腹腔注射乌司他丁 1 次，                 MyD88       上游：GGGGCATTTCACTGCTT        116
                                                                          下游：CACGAGCCCTTCTTTTCTT
          术后 7 d 每日腹腔注射乌司他丁 1 次，剂量均为 50 000
                                                              actb        上游：GAGGTATCCTGACCCTGAAGTA   104
              [13]
          U/kg 。Sham 组仅暴露盲肠，不做结扎及穿刺；Sham+                                 下游：CACACGCAGCTCATTGTAGA
          DCQD-H组仅暴露盲肠，不做结扎及穿刺，并在术前3 d                       2.7 统计学方法
          和术后7 d每天灌胃给予大承气汤8 g/kg（按生药量计）；                         采用 SPSS 26.0 软件、GraphPad Prism 9 医学绘图软
          Sham 组和 CLP 组每天均灌胃和腹腔注射生理盐水各                       件进行分析，数据以x±s表示。多组间比较采用单因素
          0.2 mL，连续10 d。                                     方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
          2.2 小鼠脓毒症评分与7 d生存率评估                               α＝0.05。
              采用小鼠脓毒症评分评价各组小鼠脓毒症严重程                          3 结果
            [14]
          度 。根据小鼠外观、行为表现、意识水平、对刺激的反                          3.1 小鼠脓毒症评分和7 d生存率测定结果
          应、睁眼反应、呼吸频率和呼吸质量等情况进行综合评                               脓 毒 症 评 分 结 果 见 图 1A。 Sham 组 和 Sham+
          分，分值越高，表明脓毒症越严重。术后7 d每天对各组                         DCQD-H组小鼠的行为正常，精神佳，反应灵敏，呼吸正
          小鼠进行脓毒症评分，并观察其存活情况，绘制7 d生存                         常，毛发光滑且发亮，眼睛完全睁开。与 Sham 组比较，
          曲线用以评估其7 d生存率。                                     CLP 组小鼠脓毒症评分显著升高（P＜0.01），毛发竖立，
          2.3 标本采集                                           行动缓慢，精神萎靡，对外界刺激（如声音、触摸）反应迟
              当小鼠的脓毒症评分超过 21 分或小鼠的呼吸频率                       钝或行动伴随着震颤，眼睛半闭或紧闭，偶有白色分泌
          和呼吸质量得分超过3分时，视为死亡，此时及时进行取                          物，呼吸频率和质量较差。与CLP组比较，DCQD-L组、
            [15]
          材 ：摘眼球取血，收集血清备用。将小鼠处死，剖取                           DCQD-H 组和 Positive 组小鼠脓毒症评分均显著降低
          肝、肺、肾、回肠组织，分批剪取适量组织装入冻存管并                         （P＜0.01），且上述症状均有所改善或缓解。
          迅速浸入液氮中，然后放入 80 ℃冰箱中保存，备用；另                            小 鼠 7  d 生 存 率 测 定 结 果 见 图 1B。 Sham 组 和
          取一部分组织浸入 4% 多聚甲醛溶液中固定，备用。其                         Sham+DCQD-H组均无小鼠死亡。与Sham组比较，CLP
          余小鼠于末次给药1 h后采用相同方法取材。                              组小鼠7 d生存率显著降低（P＜0.01），仅为40%；与CLP
          2.4 小鼠血清和回肠组织中TNF-α、IL-6水平的测定                      组比较，DCQD-L 组、DCQD-H 组、Positive 组小鼠 7 d 生
              取“2.3”项下小鼠血清和回肠组织样品适量（每组选                      存率均有不同程度的升高，分别为70%、80%、70%，其中
          取6只小鼠的样本），采用ELISA法测定其中TNF-α、IL-                    DCQD-H组小鼠7 d生存率显著升高（P＜0.05）。
          6水平，具体步骤严格按试剂盒说明书操作。                               3.2 小鼠血清和回肠组织中 TNF-α、IL-6 水平的检测
          2.5 小鼠肝、肺、肾、回肠组织的病理学形态观察                           结果
              采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。取“2.3”                         与 Sham 组比较，CLP 组小鼠血清和回肠组织中
          项下固定于 4% 多聚甲醛溶液中的小鼠肝、肺、肾、回肠                        TNF-α、IL-6 水平均显著升高（P＜0.01）。与 CLP 组比
          组织（每组选取 3 只小鼠的样本），经常规石蜡包埋、切                        较，DCQD-L 组、DCQD-H 组和 Positive 组小鼠血清和回
          片、HE染色后，置于光学显微镜下观察各组织的病理学                          肠组织中TNF-α、IL-6水平（DCQD-L组回肠组织中IL-6
                    [16]
          形态并评分 。                                            除外）均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图2。

          中国药房  2023年第34卷第17期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 17    · 2103 ·
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