Page 49 - 《中国药房》2023年16期
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2.3 大鼠分组与给药                                        2.8  大 鼠 脑 组 织 中 EPO、EPOR、JAK2、p-STAT3、
              将造模成功的大鼠按体重分为模型组、阳性对照组                         STAT3蛋白表达情况检测
         （尼莫地平，0.012 g/kg，以水为溶剂；剂量根据临床等效                         采用Western blot法进行检测。取“2.6”项下各组大
          剂量换算而得）和贯叶金丝桃高、低剂量组[5.212、1.303                    鼠的缺血再灌注侧脑组织（假手术组大鼠取相同部位脑
          g/kg，按生药量计，以水为溶剂；低剂量按圣·约翰草提取                       组织），加入蛋白裂解液后研磨，提取总蛋白并采用BCA
          物片（商品名为路优泰）的临床等效剂量换算而得]，同                          法进行定量。蛋白变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯
          时设置假手术组，每组10只。各药物组大鼠于术后第2                          酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚二氟乙烯膜上，以5%脱
                                                             脂奶粉室温封闭 1 h 后，分别加入 EPO、EPOR、JAK2、p-
          天开始灌胃相应药液，每天 1 次，连续 7 d。假手术组和
                                                             STAT3、STAT3、β-actin一抗（稀释比例均为1∶500），4 ℃
          模型组大鼠灌胃等体积水。
                                                             孵育过夜；用TBST缓冲液清洗5 min×3次，加入相应二
          2.4 大鼠神经功能评分
                                                             抗（稀释比例均为1∶1 000），室温孵育2 h；用TBST缓冲
              分别于药物干预前（造模后第1天）和末次给药后按
                                                             液清洗 5 min×3 次，以超敏 ECL 化学发光试剂显色，并
          Zea-Longa 评分法对各组大鼠进行神经功能评分，具体
                                                             置于一体化成像仪下成像。采用Image J软件分析条带
          标准如下：无神经损伤症状，记0分；不能伸展对侧前爪，
                                                             灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带的灰度值
          记1分；行走时向偏瘫侧转圈，记2分；向偏瘫侧倾倒，记
                                                             比值表示目的蛋白的表达水平，结果以假手术组为参照
                                          [10]
          3分；不能自发行走且意识丧失，记4分 。
                                                             进行归一化处理。
          2.5 大鼠脑梗死情况观察                                      2.9 大鼠脑组织中 EPO、EPOR、JAK2、STAT3 mRNA
              采用 TTC 染色法进行观察。末次给药 1 h 后，随机                   表达情况检测
          取各组大鼠5只，麻醉后，迅速断头取脑，用预冷生理盐                              采用 RT-PCR 法进行检测。取“2.6”项下各组大鼠
          水冲洗，并于－20 ℃下放置10 min，待脑组织稍硬后，切                     的缺血再灌注侧脑组织（假手术组大鼠取相同部位脑组
          除嗅球、垂体、低位脑干，由前向后行等分冠状位切片。                          织），用TRIzol试剂提取总RNA，测定浓度并稀释至250
          将上述脑组织切片置于 1%TTC 磷酸盐缓冲液中，于                         mg/L，进一步逆转录得 cDNA。以所得 cDNA 为模板进
          37 ℃下避光温育30 min（每隔10 min上下翻动1次）；经                  行 PCR 扩增。PCR 反应体系（20 μL）包括：2×Ultra‐
          4% 多聚甲醛固定后，观察各组大鼠脑组织的梗死情况                          SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各 0.8 μL，cDNA 模
         （正常脑组织呈玫瑰红色，梗死组织呈白色）并拍照。采                           板 1.6 μL，ddH2O 6.8 μL。反应条件为：95 ℃预变性 10
          用Image-Pro Plus 6.0软件分析图片并计算脑梗死比例：                 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 1 min，共 40 个循环。以
          脑梗死比例＝脑梗死总面积/脑切片总面积×100%。                          β-actin 作为内参，采用 2     －ΔΔCt  法计算 EPO、EPOR、JAK、
          2.6 大鼠脑皮层和海马组织病理形态学观察                              STAT3 mRNA的表达水平，结果以假手术组为参照进行
              采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。末次给药                       归一化处理。
                                                             2.10 统计学方法
          1 h后，取各组剩余大鼠5只，麻醉后，剖取其缺血再灌注
                                                                 采用 GraphPad Prism 6.0 软件对数据进行统计分
          侧脑组织（假手术组大鼠取相同部位脑组织），纵切，将
                                                             析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
          包含皮层和海马的脑组织固定于 4% 多聚甲醛中，经梯
                                                             分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
          度乙醇脱水、石蜡包埋后切片（厚度为 4 μm），行 HE 染
                                                             α＝0.05。
          色后，使用显微镜观察各组大鼠脑皮层和海马组织的病
                                                             3 结果
          理改变情况。
                                                             3.1 贯叶金丝桃对模型大鼠神经功能评分的影响
          2.7 大鼠脑皮层和海马组织神经细胞凋亡检测
                                                                 与假手术组比较，模型组大鼠在药物干预前、末次
              采用TUNEL染色法进行检测。取“2.6”项下各组大
                                                             给药后的神经功能评分均显著升高（P＜0.01）；与模型
          鼠脑组织切片，于 60 ℃下烘烤 60 min，经二甲苯脱蜡、
                                                             组比较，阳性对照组和贯叶金丝桃高剂量组大鼠末次给
          梯度乙醇脱水后，滴加新配制的蛋白酶 K 工作液（20
                                                             药后的神经功能评分均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。
          mg/L），于 37 ℃下孵育 10 min；用磷酸盐缓冲液清洗 3                 结果见表2。
          次，滴加 TUNEL 检测液适量，于 37 ℃下避光孵育 60                    3.2 贯叶金丝桃对模型大鼠脑梗死比例的影响
          min；用磷酸盐缓冲液清洗3次，以DAPI染液染核，使用                           与假手术组比较，模型组大鼠的脑梗死区域明显增
          荧光显微镜观察各组大鼠脑皮层和海马组织中神经细                            大，脑梗死比例显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳
          胞的凋亡情况（凋亡细胞被染成红色），并采用 Image                        性对照组和贯叶金丝桃高、低剂量组大鼠的脑梗死区域
          Scope软件计算其凋亡率：凋亡率＝凋亡细胞数/细胞总                        有所缩小，脑梗死比例均显著降低（P＜0.01）。结果见
          数×100%。                                            图1、表2。


          中国药房  2023年第34卷第16期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 16    · 1963 ·
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