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用抗原修复，封闭，以兔抗人 OCTN2 抗体为一抗（稀释                                  表 1 引物序列及扩增产物大小
          比1∶200），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗                        基因          序列（5′→3′）                 扩增产物大小/bp
                                                              OCTN2       上游：TGGTGGTTCATCCCTGAGTC      109
         （稀释比 1∶200），用 3，3′-二氨基联苯胺染色，复染，返
                                                                          下游：AAGGCACAACAATCCCATTGG
          蓝，脱水封片，采用显微镜观察并采集图片。                                β-actin     上游：CATGTACGTTGCTATCCAGGC     250
          2.3 细胞原代培养                                                      下游：CTCCTTAATGTCACGCACGAT
              取“2.1”项下液氮罐中的标本，于37 ℃快速复温，用                     2.6 前列腺癌细胞中OCTN2蛋白表达检测
                                                                  采用Western blot法检测。取“2.3”项下的纯化前列
          DMEM/F-12培养液（含100 U/mL青霉素、50 U/mL庆大
          霉素）冲洗3次，剪碎，加入2倍体积的DMEM/F-12培养                       腺癌细胞悬液及HEK293 细胞悬液各适量，提取细胞总
                                                              蛋白，绘制标准曲线，计算蛋白样品浓度。将总蛋白于
          液（含 0.25% 胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型胶原酶、0.02% 乙二胺
                                                              100 ℃变性 10 min，经电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯
          四乙酸），于37 ℃恒温水箱中振荡消化30 min；之后，加
                                                              膜，用脱脂奶粉封闭，TBS 缓冲液清洗，加入兔抗人
          入同体积培养液（含 20% 胎牛血清、80%DMEM/F-12 培
                                                              OCTN2 抗体（稀释比 1∶1 000），于 4 ℃冰箱过夜，再用
          养液、100 U/mL 青霉素、50 U/mL 庆大霉素）终止消化，
                                                              TBS缓冲液清洗回收一抗，加入辣根过氧化物酶标记的
          以 1 500 r/min 离心 5 min；弃上清液，用含 5 ng/mL 表皮
                                                              山羊抗兔 IgG（稀释比 1∶1 000），孵育 1 h，凝胶成像，显
          生长因子和 50 g/mL 牛垂体提取物的培养液重悬，转移
                                                              影。采用 ALLDOC 软件进行扫描处理，以 OCTN2 与内
          至Ⅰ型胶原包被的细胞培养瓶中，于5%CO2、37 ℃下培
                                                              参（β-actin）的积分光密度比值表示蛋白表达水平，实验
          养，待细胞达 80% 融合时，用 0.125% 胰蛋白酶消化传
                                                              重复3次。
          代。连续3次传代培养，得纯化前列腺癌细胞。重悬细
                                                              2.7 前列腺癌细胞对奥沙利铂的敏感性检测
          胞，用锥虫蓝染色，在显微镜下计数。根据计数结果，将
                                                                  取“2.6”项下OCTN2蛋白表达最高及最低的前列腺
                             6
          细胞密度调整为1×10 个/mL，备用。
                                                              癌细胞悬液各100 μL，置于96孔培养板中，再分别加入
          2.4 前列腺癌细胞对奥沙利铂的摄取量检测
                                                              0.390 625、0.781 125、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、
              取“2.3”项下的纯化前列腺癌细胞悬液，按每孔 1
                                                              100、200、500 μmol/L的奥沙利铂，另设无药对照孔和空
          mL加入至6孔培养板中，再加入适量培养液，于37 ℃下
                                                              白孔（检测背景信号）。各孔设 3 个平行孔，于 5%CO2、
          培养48 h；待细胞贴壁后，吸出培养液，加入足量含低浓
                                                              37 ℃下培养 5 d，按 ATP-TCA 试剂盒说明书操作，检测
          度（0.1 μmol/L）奥沙利铂的培养液，培养 24 h 后用冷生
                                                              560 nm 波长处的吸光度，计算细胞生存率。细胞生存
          理盐水洗脱 3 次，胰蛋白酶消化回收细胞，以 800×g 离
                                                              率＝（被检测孔吸光度－空白孔吸光度）/（无药对照孔吸
          心5 min，弃上清液，用适量三蒸水悬浮细胞。取等量细
                                                              光度－空白孔吸光度）×100%。将数据导入 Graphpad
          胞悬液，一份按BCA试剂盒说明书操作，检测总蛋白含
                                                              Prism 7.05软件，计算半数抑制浓度（half maximal inhibi‐
          量；另一份用 65% 硝酸处理，在 120 ℃下干燥得含铂离
                                                              tory concentration，IC50 ）。
          子（Pt）的待测样品，采用电感耦合等离子体质谱法检                           2.8 奥沙利铂对前列腺癌细胞的抑制作用检测
          测细胞内Pt浓度，以Pt质量浓度（ng/mL）与总蛋白含量
                                                                  取“2.3”项下的纯化前列腺癌细胞悬液，置于 96 孔
         （mg/mL）的比值表示前列腺癌细胞对奥沙利铂的摄                            培养板中，每孔100 μL，每组（每例患者的前列腺癌细胞
          取量。                                                 为 1 组）设 8 个复孔，另设空白对照组（只加培养液），于
          2.5 前列腺癌细胞中OCTN2 mRNA表达检测                           5%CO2、37 ℃下培养 48 h，待细胞贴壁后，吸出培养液，
              取“2.3”项下的纯化前列腺癌细胞悬液及 HEK293                     其中 4 个孔（实验组）加入含 50 μmol/L 奥沙利铂（说明
          细胞悬液各 100 μL，分别采用 Trizol 法提取总 RNA，并                 书血药峰浓度）的培养液，另外4个孔（对照组）加入不含
          测定其在 260 nm 波长处的吸光度，计算总 RNA 浓度。                     奥沙利铂的培养液，所有细胞均继续培养 4 h。采用
          总 RNA 经 DNA 酶处理后，采用 Superscript Ⅱ试剂盒逆               MTT法，检测各组细胞的光密度（OD）值，并计算细胞增

          转录成 cDNA。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，以 β-肌                  殖抑制率。细胞增殖抑制率＝（对照组 OD 值－实验组
          动 蛋 白（β -actin）为 内 参 ，采 用 2   －ΔΔCt  法 计 算 OCTN2    OD值）/（对照组OD值－空白对照组OD值）×100%。
          mRNA 的表达水平，实验重复 3 次。扩增条件为：95 ℃                      2.9 统计学分析
          预变性 2 min；94 ℃变性 20 s、56 ℃退火 20 s、72 ℃延伸                采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析，数据以 x ˉ±s
          30 s，共40个循环。采用Primer 3.0软件设计引物，引物                   表 示 。 相 关 性 分 析 采 用 Spearman 法 。 检 验 水 准
          序列及扩增产物大小见表1。                                       α＝0.05。


          · 1470 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 12                            中国药房  2023年第34卷第12期
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