Page 50 - 《中国药房》2023年5期
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2 方法                                                2.6 小鼠肾脏组织中Fn、α-SMA、Nrf2、GPx4蛋白阳性
          2.1 分组、造模与给药                                        表达的检测
              将 30 只小鼠随机分为假手术组、模型组、厄贝沙坦                           采用免疫组化法进行检测。取“2.4”项下各组小鼠
          组（阳性对照，20 mg/kg，剂量为临床等效剂量）和黄柏酮                      剩余部分的切片，经二甲苯脱蜡、水化后，用柠檬酸二钠
          低、高剂量组（10、40 mg/kg，低剂量参考文献[11]设置），                  抗原修复液（pH6.0）热修复 10 min，待切片温度降至室
          每组6只。除假手术组外，其余各组小鼠均通过结扎单                            温后，根据免疫组化试剂盒说明书进行操作，然后滴加
          侧输尿管建立 UUO 模型，具体造模方法参考文献[12]：                       Fn（稀释度为1∶200）、α-SMA（稀释度为1∶200）、Nrf2（稀
          小鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥钠进行麻醉，以 75% 乙醇消                       释度为1∶100）、GPx4（稀释度为1∶200）抗体，4 ℃孵育过
          毒右侧背部毛发及皮肤，从小鼠背部右侧靠近肾脏位置                            夜，使用DAB显色试剂盒显色，终止显色后再以苏木素
          切开 1～2 cm 的切口；逐层切开皮肤、肌肉各层，暴露并                       复染切片 3 min，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树
          分离右侧肾脏及输尿管，使用手术线 4-0 对输尿管近肾                         胶封片后，采用显微镜进行观察，棕色越深表明目的蛋
          端进行双结扎，中间剪断，逐层缝合。假手术组除不结                            白表达越强。
          扎、不剪断输尿管外，其余操作相同。术后，给药组小鼠                           2.7 小鼠肾脏组织中Fn、α-SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11
          腹腔注射相应药物，假手术组、模型组小鼠腹腔注射等                            蛋白表达水平的检测

          体积生理盐水，每天1次，连续7 d。
                                                                  采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下各组小
          2.2 样本采集
                                                              鼠冻存的肾脏组织适量（约100 mg），剪碎、冰上研磨，添
              术后第8天，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，心
                                                              加预冷的蛋白裂解液冰上裂解 20 min，超声（功率 200
          脏取血，室温放置 30 min，于 4 ℃ 条件下以 3 500 r/min
                                                              W，频率20 kHz）处理2 s×5次，于4 ℃ 条件下以12 000
          离心10 min，取上层血清，用于检测Cr、BUN水平，MDA
                                                              r/min 离心 10 min；吸取上清液，采用考马斯亮蓝法测定
          含量以及T-SOD活力。取血完成后，采用颈椎脱臼法处
                                                              蛋白浓度后，煮沸变性，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
          死小鼠，摘取右侧肾脏，去除包膜并用磷酸盐缓冲液
                                                              胺凝胶电泳；转膜，5% 脱脂牛奶封闭，分别加入 Fn、
         （PBS）冲洗后将其分为 2 份：一份放入 10% 甲醛溶液中
                                                              α-SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11、GAPDH 抗体（稀释度均
          固定，用于病理切片染色和免疫组化分析；一份保存
                                                              为 1∶1 000），4℃孵育过夜；TBST 洗膜 3 次，加入二抗
          于－80 ℃，用于 Fe 浓度测定及 Western blot、实时定量
                          2+
                                                             （稀释度为 1∶10 000），室温孵育1 h；TBST洗膜3次，滴
          PCR检测。
                                                              加ECL化学发光液显影，置于凝胶成像系统下成像。采
          2.3 小鼠肾功能指标的检测
                                                              用 Image J 软件进行灰度值量化分析，以目的蛋白与
              取“2.2” 项下各组小鼠血清样品适量，根据相应试
                                                              GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
          剂盒说明书方法操作，检测Cr、BUN的水平。
                                                              2.8 小鼠肾脏组织中Fn、α-SMA、Nrf2、GPx4、SLC7A11
          2.4 小鼠肾脏组织病理形态学观察
                                                              mRNA表达水平的检测
              取“2.2”项下各组小鼠固定于 10% 甲醛溶液中的肾
                                                                  采用实时定量PCR法进行检测。取“2.2”项下各组
          脏组织，用水冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡
                                                              小鼠冻存的肾脏组织适量，使用 Trizol 试剂提取小鼠肾
          包埋后，切片（厚度为 4 μm）备用。取部分切片于 65 ℃
          烘烤2 h后用二甲苯脱蜡、梯度酒精复水，经HE染料（苏                         组织中的总 RNA，经酶标仪测定其含量后，逆转录为
                                                              cDNA，再进行 PCR 反应。PCR 反应体系为上下游引物
          木精染色 5 min，伊红染色 40 s）染色后在光学显微镜下
          观察肾脏组织的病理形态学改变；再取部分切片经脱蜡                            各 1 μL、2×扩增试剂 10 μL、cDNA 模板 2 μL、无酶水 6
          复水后参照说明书方法进行 Masson 染色，以评估肾脏                        μL。PCR反应条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15
          组织纤维化情况。                                            s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 20 s，共 40 个循环。使用
          2.5 小鼠肾脏组织中 Fe 浓度及血清中 MDA 含量、T-                     GAPDH作为内参基因，通过2          －ΔΔCt 方法计算目的基因的
                                2+
          SOD活力的检测                                            表达水平。
              取“2.2”项下各组小鼠冻存的肾脏组织适量（约100                      2.9 统计学方法
          mg），以冷PBS洗净，根据Fe 浓度检测试剂盒说明书方                            采用 GraphPad Prism 9.0 软件对数据进行统计学分
                                  2+
                                  2+
          法操作，计算肾脏组织中Fe 浓度。另取“2.2”项下各组                        析，数据以表示x±s表示。多组间比较采用单因素方差
          小鼠的血清样品适量，根据MDA、T-SOD试剂盒说明书                         分 析 ，组 间 两 两 比 较 采 用 LSD-t 检 验 。 检 验 水 准
          方法操作，计算小鼠血清中MDA含量及T-SOD活力。                          α＝0.05。


          · 556 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 5                               中国药房  2023年第34卷第5期
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