Page 72 - 《中国药房》2023年4期
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号 ZLI-9018）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔                       观情况；于腹主动脉取血，以3 000 r/min离心10 min，取
          抗大鼠 p38 MAPK、磷酸化 p38 MAPK（phosphorylated            上清液于－80 ℃下保存；然后，沿耳基线剪下双耳，用8
          p38 MARK，p-p38 MAPK）抗体（批号分别为 bs-0637R、              mm 打孔器在左右耳中部同一位置打孔取圆形耳片，称
          bs-0637R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗                        定质量；剖取大鼠背部皮肤组织，以生理盐水冲洗后分
          大鼠 β-肌动蛋白（β-actin）抗体、RIPA 裂解液、磷酸化蛋                  为2份，其中1份用4%中性甲醛溶液固定，1份用液氮速
          白酶抑制剂、BCA 蛋白定量检测试剂盒、十二烷基硫酸                          冻后于－80 ℃下保存；剖取大鼠肝脏、肾脏，以生理盐水
          钠-聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒、显影定影试剂、ECL试                          清洗后用液氮速冻后于－80 ℃下保存。
          剂盒、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标             2.3 大鼠一般情况观察与湿疹严重度评分
          记的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二                     观察各组大鼠的一般情况并对其背部皮肤湿疹严
          抗（ 批 号 分 别 为 GB12001、G2002、G2007、G2026、             重度进行评分。评分参考湿疹面积及严重度指数（ec‐
          G2003、G2019、G2014、GB23303）均购自武汉塞维尔生                 zema area and severity index，EASI）评分法 并略作改
                                                                                                   [11]
          物科技有限公司；氨基甲酸乙酯（批号20210902）购自天                       动，仅以红斑、水肿的变化情况来评估药物的干预效果，
          津市光复科技发展有限公司；苏木精、伊红染色液（批号                           具体标准如下：红斑、水肿的严重程度均包括无、轻微、
          分别为 190805、20211009）均购自福州飞净生物科技有
                                                              中度、中重度、重度，分别记0、1、2、3、4分；综合评分为红
          限公司；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
                                                              斑、水肿评分的总和。
          1.3 实验动物
                                                              2.4 大鼠耳肿胀度检测
              健康雄性SD大鼠，8周龄，体质量180～200 g，购自
                                                                  称定各组大鼠圆形耳片的质量，并按下式计算耳肿
          郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，动物生产许可证号
                                                              胀度：耳肿胀度（mg）＝右耳片质量（mg）－左耳片质量
          为 SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠均分笼饲养于河南
                                                             （mg）。
          中医药大学医学机能实验室（室温20～22 ℃，相对湿度
                                                              2.5 大鼠皮肤组织形态学观察
          55%～60%，正常光照），并自由饮水、摄食。本实验方案
                                                                  取“2.2”项下固定于中性甲醛溶液的背部皮肤组织，
          获河南中医药大学实验动物伦理委员会批准（编号
                                                              经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片（4 μm），
          DWLL202201010），实验过程及动物处置严格遵守“3R”
                                                              再经二甲苯脱蜡、苏木精-伊红（HE）染色、梯度乙醇脱
          原则。
          2 方法                                                水、二甲苯透明，以中性树胶封片，置于光学显微镜下观
                                                              察皮肤组织病理学变化。大鼠背部皮肤病变程度评价
          2.1 分组、造模与给药
                                                                          [12]
                                                              参考 Fukuda 等 提出的组织病理学评分方法并略作改
              取雄性SD大鼠50只，适应性饲养1周后，脱其腹部
                                                              动，仅对表皮损伤、增厚、过度角化、真皮水肿和炎症5个
          及背部毛，裸露皮肤（面积 2 cm×2 cm），以 DNFB-丙酮
                                                              方面进行评分，具体标准如下：上述5个方面的严重程度
          橄榄油溶液（体积比4∶1，下同）100 μL涂抹于大鼠腹部
                                                              均包括相对正常、轻度、中度、中度到显著、显著，分别记
          脱毛区致敏，每天 1 次，连续 2 d。首次致敏 5 d 后，以
                                                              0、1、2、3、4分；病理评分为表皮损伤、增厚、过度角化、真
          DNFB-丙酮橄榄油溶液 100 μL 涂抹于大鼠背部脱毛区
                                                              皮水肿、炎症程度评分的总和。
          激发，同时以 DNFB-丙酮橄榄油溶液 5 μL 涂抹于大鼠
                                                              2.6 大鼠皮肤组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表
          右耳内外侧激发，每 3 天 1 次，共 5 次，以脱毛区出现红
                                                              达水平及p38 MAPK蛋白磷酸化水平检测
          斑、水肿、脱屑为标准，建立湿疹大鼠模型 。将50只湿
                                             [10]
                                                              2.6.1 免疫组化实验 取“2.5”项下的皮肤组织切片，经
          疹模型大鼠随机分为模型组、氯雷他定组、TWP组、TGP
          组和配伍组（TWP+TGP），每组10只；另取10只大鼠，作                      二甲苯脱蜡、水化后，用柠檬酸盐缓冲液热修复 8 min，
          为正常组。氯雷他定、TWP、TGP成人（体质量70 kg）用                      待降至室温后依次用H2O2孵育（10 min）、磷酸盐缓冲液
          量分别为 10、105、1 800 mg，根据公式 S 大鼠/200 g＝0.018×         浸洗、山羊血清孵育（30 min），然后滴加 p38 MAPK、p-
          S 人/70 kg （S 大鼠/200 g、S 人/70 kg分别为大鼠、人用量），换算得大鼠     p38 MAPK 一抗（稀释度均为 1∶100），于 4 ℃下孵育过
          氯雷他定、TWP、TGP的用量分别为0.9、9.45、162 mg/kg，               夜。次日，将切片于37 ℃下复温30 min，滴加HRP标记
          故以此作为各药物组的给药剂量。上述药物均以 0.1%                          的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释度为 1∶200）孵育 20 min，用
          羧甲基纤维素钠溶液为溶剂，制备相应混淆液并于首次                            磷酸盐缓冲液浸洗，以DAB显色10 min；用水冲洗后，用
          致敏 3 d 后开始灌胃，各药物组大鼠的灌胃体积为 10                        苏木精复染 3 min，经盐酸乙醇分化、水冲洗后，进行梯
          mL/kg；正常组和模型组大鼠灌胃等体积0.1%羧甲基纤                        度乙醇脱水、二甲苯透明，以中性树胶封片，置于光学显
          维素钠溶液，每天1次，连续21 d。                                  微镜下观察。于 400 倍镜下随机选取 1 个视野，以棕黄
          2.2 取材及处理                                           色为阳性染色，采用Image-Pro Plus 6.0软件检测阳性染
              末次给药 24 h 后，称定各组大鼠体质量，并腹腔注                      色区域的积分光密度（integrated optical density，IOD）
          射氨基甲酸乙酯1 g/kg进行麻醉，观察大鼠背部皮肤外                         值，以评价p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达水平。


          · 446 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 4                               中国药房  2023年第34卷第4期
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