Page 38 - 《中国药房》2022年22期
P. 38

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一种糖尿             水为蒸馏水。
          病引起的以肾间质发生纤维化为核心病理特征的微血                             1.3 实验动物
          管病变，也是导致糖尿病患者康复率低的重要原因之                                 SPF 级健康 C57BL/6 小鼠共 50 只，雄性，体质量
          一 。已有研究证实，肾小管上皮细胞间充质转分化                             20～24 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许
            [1]
         （epithelial-mesenchymal transition，EMT）是诱导肾间质        可证号为 SCXK（沪）2017-0005。所有小鼠用标准颗粒
                                   [2]
          发生纤维化的关键步骤之一 。锌指转录因子 1（Snail                        饲料饲养，自由饮水，灯光照射 12 h 模拟昼夜交替循
          family transcriptional repressor 1，Snail1）和卵泡抑素样    环。本实验在泉州医学高等专科学校动物实验中心
          蛋白 1（follistatin-like protein 1，Fstl1）、蛋白激酶 B（pro‐  进行。
          tein kinase B，Akt）均在EMT中发挥重要作用         [3－4] 。
                                                              2 方法
              香豆素类衍生物蛇床子素（osthole，OST）广泛分布
                                                              2.1 DN造模
                                              [5]
          于伞形科植物蛇床子中，在抗心肌纤维化 和肝脏纤维
                                                                  参考相关文献      [8－9] 中的方法，先建立糖尿病小鼠模
            [6]
          化 方面均有一定作用。本课题组前期研究发现，OST
                                                              型，成功后继续喂养 12 周，建立 DN 小鼠模型。具体操
          能有效预防单侧输尿管梗阻模型小鼠的肾间质纤维
                                                              作如下：取40 只小鼠按120 mg/kg一次性尾静脉注射链
            [7]
          化 ，在此基础上，OST在其他肾损伤中，特别是对DN肾
                                                              脲佐菌素（溶解于临时配制的 pH4.5、0.1 mol/L 柠檬酸-
          间质纤维化是否仍有预防作用值得进一步研究。本研
                                                              柠檬酸钠缓冲液中，无菌），自由饮食饮水，3 d 后禁食 6
          究选用OST对DN模型小鼠进行预防性给药，观察其对
          小鼠肾间质纤维化的影响，并对 Fstl1/Akt/Snail1 通路中                 h，断尾取血测空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L 判定
          的关键蛋白进行测定，旨在为临床筛选 DN 防治药物提                          为糖尿病造模成功。糖尿病模型小鼠继续喂养12周，测
          供新的思路。                                              定24 h尿蛋白＞30 mg，则认为DN造模成功。
          1 材料                                                2.2 分组与给药
          1.1 主要仪器                                                将造模成功的糖尿病模型小鼠随机分为模型组和
                                                                                                 [7]
              本研究所用主要仪器包括逸智 F 型罗氏逸智血糖                         OST 低、中、高剂量（20、40、80 mg/kg）组 ，每组 10 只。
          仪（德国罗氏诊断有限公司），5810R型高速冷冻式离心                         另取 10 只未造模小鼠为正常对照组。各组小鼠于糖尿
          机（德国 Eppendorf 公司），UVmini-1240 型紫外-可见分              病造模成功后开始干预（灌胃处理），每日 1 次，持续 12
          光光度计（日本岛津国际贸易上海有限公司），VE-180型                        周。正常对照组和模型组小鼠仅灌胃等体积溶剂，OST
          垂直电泳仪和Tanon-3500型全自动凝胶成像仪（上海天                       各剂量组小鼠灌胃相应剂量的OST，所有溶剂均为0.2%
          能科技有限公司）。                                           羧甲基纤维素钠溶液。灌胃12周内小鼠无死亡。
          1.2 主要药品与试剂                                         2.3 生化指标的测定
              OST（纯度≥95%，批号 78889）和链脲佐菌素（纯                        各组小鼠末次灌胃 24 h 后，禁食 6 h 后断尾取血测
          度≥98%，批号 S0130）均购于美国 Sigma 公司；肌酐检
                                                              空腹血糖；收集小鼠 24 h 尿液和血清，按照相应试剂盒
          测试剂盒和尿素氮检测试剂盒（批号分别为 700460-2、
                                                              说明书测定 24 h 尿蛋白、血肌酐（serum creatinine，Scr）
          SKT-213-192）均购于武汉艾美捷科技有限公司；尿蛋白
                                                              和尿素氮水平。
          检测试剂盒（批号 GD-VN9853）购于上海古朵生物科技
                                                              2.4 肾间质纤维化的观察
          有限公司；Masson三色染色试剂盒（批号16071）购于上
                                                                  收集各小鼠 24 h 尿液后，处死小鼠，取相同部位的
          海源叶生物科技有限公司；E-钙黏蛋白（E-cadherin）免
                                                              肾皮质，常规石蜡包埋、切片（3 µm），行Masson染色，光
          疫组化检测试剂盒（批号 GOY-Y1007）购于上海谷研实
                                                              镜下观察肾间质区域胶原纤维的沉积情况，使用Image J
          业有限公司；波形蛋白（vimentin）免疫组化检测试剂盒
                                                              软件对胶原纤维（染成蓝色）进行定量分析。
         （批号US-132）购于上海研生生化试剂有限公司；兔抗大
                                                              2.5 肾皮质中E-cadherin和vimentin表达水平的检测
          鼠 Fstl1、Snail1、vimentin、Akt、磷酸化 Akt（p-Akt）、β-肌
          动蛋白（β-actin）多克隆抗体和小鼠抗大鼠E-cadherin单                      取各组小鼠肾皮质，经固定、脱水、石蜡包埋、切
          克隆抗体（批号分别为 ab232777、ab82846、ab137321、               片（3 µm）后，按免疫组化检测试剂盒说明书进行肾
          ab235958、ab8932、ab8227、ab76055）均购于英国 Abcam          皮质 E-cadherin、vimentin 染色，光镜下观察肾皮质中
          公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、小鼠免疫球蛋                            E-cadherin 和 vimentin 的分布并对结果进行量化。每张
          白 G 二抗（批号分别为 A0208、A0216）均购于上海碧云                    切片任选5个视野拍照，以胞质内出现棕黄色或黄色颗
          天生物技术有限公司；其余试剂均为实验室常用规格，                            粒且强度大于非特异性背景为阳性表达，使用 Image


          · 2720 ·    China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 22                            中国药房  2022年第33卷第22期
   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43