Page 63 - 《中国药房》2022年21期
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2.1.3  时间-杀菌曲线的绘制          选择对黄绵马酸 BB 敏            匹罗星软膏组和 0.5%、1%、2% 黄绵马酸 BB 乳膏组，每
          感且稳定性好的MRSA11和MSSA23作为受试菌，并将                       组12只。每天早晚各涂药1次，每次涂药量为0.1 g/只，
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          受试菌菌液浓度调整至 1.0×10 CFU/mL，然后设置黄                     连续给药10 d。
          绵马酸BB中、高浓度组（浓度分别为MIC、2MIC），同时                      2.2.3  小鼠皮肤脓肿体积的测定            各组小鼠给药后，每
          设置对照组和莫匹罗星中、高浓度组（浓度分别为MIC、                         隔1天测量1次皮肤脓肿的长径（L）与宽径（W），并计算
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          2MIC）。在试管中加入各组药液 1.0 mL 后再加入等量                     脓肿体积（V），具体公式为V＝（π/6）·L·W 。
          菌液（对照组仅含菌液不含药液），于 35 ℃振荡培养。                        2.2.4  小鼠皮肤脓肿部位细菌含量的检测                 实验第 11
          分别在培养0、1、2、4、6、8、12、16、20、24、36 h时取样，采             天脱臼处死小鼠，取脓肿部位皮肤 0.1 g（剩余部分用于
          用平板法计算活菌数并绘制时间-杀菌曲线。杀菌作                            病理切片的制备），加入9倍量无菌生理盐水后，用组织
          用的判定标准：细菌存活数从初始接种数量下降≥3                            捣碎机研磨制成皮肤匀浆液。将皮肤匀浆液稀释 100
          lg CFU/mL时，则认为杀菌率达99.9%，药物在该浓度下                    倍，取 20 μL 均匀涂于营养琼脂培养基上，于 35 ℃培养
                            [14]
          对受试菌有杀菌作用 。                                        24 h后，肉眼观察培养基上的菌落数。
          2.1.4  黄绵马酸BB与莫匹罗星的联合抑菌实验                  根据      2.2.5  小鼠皮肤脓肿部位的病理形态学观察                   取各组
         “2.1.2”项下的测定结果，选择抑菌效果较好的黄绵马酸                        小鼠脓肿部位皮肤，按常规方法制备病理切片，以苏木
          BB 和莫匹罗星进行联合抑菌实验，采用棋盘微量稀释                          精伊红染色，采用光学显微镜观察小鼠的皮肤病理形态
            [15]
          法 进行检测。根据药物单用时对受试菌的MIC值，将                          学变化。
          黄绵马酸 BB（A 药）和莫匹罗星（B 药）的最大给药浓度                      2.3 黄绵马酸BB对MRSA及MSSA的作用机制考察
          设定为 2MIC，分别在 96 孔板的横向和纵向进行一系列                      2.3.1  黄绵马酸BB对两种细菌形态的影响考察                   参考
          二倍稀释，然后各孔加入等量菌液（菌液浓度为 1.0×                         文献[18]方法，将MRSA11、MSSA23菌株培养至对数生
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          10 CFU/mL），于 35 ℃培养 18～24 h，根据“2.1.2”项下            长期后，调整菌液浓度为1.0×10 CFU/mL，再分别接种
                                                                                         6
          方法测定各药物联合后的 MIC。以上操作重复 3 次。                        于不同的6孔板上（每孔1 mL），然后分为对照组和黄绵
          以联合抑菌指数（fractional inhibitory concentration in‐    马酸 BB 低、中、高浓度组（浓度分别为 1/2MIC、MIC 和
          dex，FICI）作为联合抑菌结果的判断依据：FICI≤0.5 为                  2MIC）。除对照组不加药物外，其余各组均加入1 mL相
          协同作用，0.5＜FICI≤1为相加作用，1＜FICI≤2为无关                   应药液，于 35 ℃培养 4 h 后，以 5 000 r/min 离心 10 min；
          作用，FICI＞2 为拮抗作用 。FICI 的计算方式如下：                     收集菌体，加入 2.5% 戊二醛溶液 1 mL，置于 4 ℃固定 4
                                 [16]
          FICI＝FICA药+FICB药，FICA药＝MICA药联合/MICA药单用，FICB药＝      h，然后采用扫描电镜观察MRSA11和MSSA23的形态。
          MICB药联合/MICB药单用。                                   2.3.2  黄绵马酸BB对两种细菌核酸外渗含量的影响考
          2.2  黄绵马酸 BB 乳膏对皮肤脓肿模型小鼠的改善作                       察   参考文献[19]方法，将MRSA11、MSSA23菌株培养
          用考察                                                至对数生长期后，调整菌液浓度为 1.0×10 CFU/mL，再
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          2.2.1  黄绵马酸 BB 乳膏的制备         参考文献[17]方法制           按“2.3.1”项下方法分组、加药、培养、离心后，取上清液，
          备黄绵马酸 BB 乳膏：称取凡士林 6 g、液体石蜡 8 g、十                   采用酶标仪于260 nm处测定吸光度值，吸光度值越大，
          八醇5 g、单硬脂酸甘油酯7 g、脂肪醇聚氧乙烯醚4 g、月                     表明细菌核酸外渗含量越高。
          桂氮酮1 g、对羟基苯甲酸甲酯0.3 g、对羟基苯甲酸丙酯                      2.3.3  黄绵马酸BB对两种细菌胞外蛋白含量的影响考
          0.2 g、2，6-二叔丁基对甲酚 0.5 g，加热至 80 ℃溶解，搅               察   参考文献[20]方法，取0、5、10、20、30、40、50、60、70、
          匀；降温至 65 ℃时，加入黄绵马酸 BB 粉末 0.5 g 搅拌溶                 80、90、100 μg/mL 的牛血清蛋白标准溶液各 200 μL，加
          解，作为油相，备用。另外称取甘油12 g、乙二胺四乙酸                        入 5 mL 考马斯亮蓝溶液，室温放置 5 min；采用酶标仪
          二钠 0.02 g，加适量纯化水（乳膏总量为 100 g），加热至                  于595 nm波长处测定吸光度值，以牛血清蛋白质量浓度
          65 ℃溶解，作为水相，备用。将油相缓缓倒入水相中，边                        为 横 坐 标 、吸 光 度 值 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 。 将
          加边搅拌至室温，即得0.5%黄绵马酸BB乳膏。同法制                         MRSA11、MSSA23菌株培养至对数生长期后，调整菌液
          备1%、2%黄绵马酸BB乳膏及不含药物的基质，于4 ℃                        浓度为1.0×10 CFU/mL，再按“2.3.1”项下方法分组、加
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          保存，备用。                                             药、培养、离心后，取上清液200 μL，加入5 mL考马斯亮
          2.2.2  造模、分组及给药          分别建立以 MRSA11 或            蓝溶液，室温放置 5 min；采用酶标仪于 595 nm 波长处
          MSSA23 感染的小鼠皮肤脓肿模型：将小鼠背部脱毛、                        测定吸光度值，然后将吸光度值代入标准曲线计算，即
          消毒后，取 60 只皮下注射 MRSA11（菌液浓度为 1.0×                   得蛋白含量。
          10 CFU/mL），另外60只皮下注射MSSA23（菌液浓度为                   2.4 统计学方法
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          5.0×10 CFU/mL），注射体积均为 0.1 mL。造模次日，                     采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，数据均用x±s
          观察小鼠背部皮肤，若出现脓包、红肿，则表明造模成                           表示，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准
          功。将造模成功的两种感染小鼠均随机分为基质组、莫                           α＝0.05。


          中国药房    2022年第33卷第21期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 21  ·2617·
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