Page 41 - 《中国药房》2022年11期
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2 方法                                               材与处理。肾上腺、甲状腺、睾丸组织用4％甲醛溶液固
        2.1 分组、造模与给药                                       定，再进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、
            大鼠适应性喂养 1 周，根据体质量按随机数字表法                       乙醇梯度脱蜡、HE染色，采用光学显微镜观察组织病理

        分为正常组、模型组、金匮肾气丸组（阳性对照）、人参                          形态学变化并拍照。
        组、蛤蚧组、配伍组，每组8只。除正常组外，其余组大鼠                         2.7  大鼠下丘脑 CRH、TRH、GnRH mRNA 表达水平
        每天后腿肌内注射氢化可的松25 mg/kg，连续15 d进行                     检测
        造模，根据参考文献[10]判断造模是否成功；正常组同期                            采用 qRT-PCR 法检测。根据“2.1”项下分组、造模
        肌内注射等体积生理盐水。造模成功后，对各组大鼠进                           与给药，根据“2.3”项下取材与处理。取－80 ℃冻存的
        行灌胃。金匮肾气丸组灌胃剂量为2.33 g/kg，临用时用                      下丘脑（每组取3只小鼠样本），先用Trizol提取总RNA，
        生理盐水配制。人参、蛤蚧按照配方颗粒量/饮片量比                           反转录成 cDNA 后行 PCR 扩增，用以检测 CRH、促甲状
        例、人体质量60 kg换算，并参照人与大鼠体表面积折算                        腺激素释放激素（thyrotropin releasing hormone，TRH）、
                          [11]
        的等效剂量比值换算 ，临用时用生理盐水溶解，37 ℃                         促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，
        水浴搅拌 5 min，配制混悬液。人参组灌胃剂量为 0.53                     GnRh）mRNA 表达水平。引物由生工生物工程（上海）
        g/kg（临床等效剂量的 2 倍），蛤蚧组灌胃剂量为 0.21                    股份有限公司合成，引物序列及产物长度见表1。
                                                                     表1 PCR引物序列及产物长度
        g/kg（临床等效剂量的 2 倍），配伍组灌胃剂量为人参配
        方颗粒 0.53 g/kg 和蛤蚧配方颗粒 0.21 g/kg。模型组和                基因               引物序列                  产物长度/bp
                                                            GAPDH    上游：5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA-3′  124
        正常组灌胃等体积生理盐水。所有大鼠灌胃体积均为                                      下游：5′-TGGTAACCAGGCGTCCGATA-3′
        10 mL/kg，每日1次，共灌胃28 d。                              TRH      上游：5′-CAGCCAGTTTGCACTCTTCAG-3′  142
                                                                     下游：5′-GGCGCAGGATTCAGGGATAC-3′
        2.2  大鼠体质量、肛温测定                                     CRH      上游：5′-AGAACAACAGTGCGGGCTCA-3′   117
            分别于灌胃前和灌胃第7、14、21、28天，采用电子天                              下游：5′-AGGCAGACAGGGCGACAGA-3′
                                                            GnRH     上游：5′-GCCGCTGTTGTTCTGTTGACT-3′  142
        平测定大鼠体质量，采用电子体温计测定大鼠肛温。
                                                                     下游：5′-CCATTTGATCCTCCTCCTTGC-3′
        2.3  取材与处理
                                                           2.8  统计学分析
            灌胃 28 d 后，大鼠禁食不禁水 12 h，然后以水合氯
                                                               采用 SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料以
        醛麻醉，腹主动脉取血。血样以3 000 r/min于4 ℃离心                    x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
        10 min，取上清液于－80 ℃保存。腹主动脉取血后，在                      两比较采用LSD-t检验，检验水准α＝0.05。
        冰上将大鼠左右肾上腺、甲状腺、左右睾丸完整剪下，生                          3 结果
        理盐水洗净，置于 4％甲醛溶液中固定。在冰下摘取大
                                                           3.1  人参与蛤蚧配方颗粒配伍对肾阳虚模型大鼠体质
        鼠下丘脑，置于冻存管在－80 ℃保存待测。                              量、肛温的影响
        2.4  大鼠血清cAMP、cGMP水平检测                                 与正常组比较，模型组大鼠体质量在不同时点均显
            采用 ELISA 法检测。根据“2.1”项下分组、造模与                   著降低（P＜0.01）。各给药组大鼠灌胃前体质量差异无
        给药，根据“2.3”项下取材与处理。按相应试剂盒说明书                        统计学意义（P＞0.05）；灌胃第7、14、21、28天，各给药组
        方法检测大鼠血清 cAMP、cGMP 水平并计算 cAMP/                     大鼠体质量均有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞
        cGMP。                                              0.05）。与配伍组比较，人参组、蛤蚧组大鼠体质量在不
        2.5  大鼠 HPA 轴（CRH、ACTH、CORT）、HPT 轴（T3、             同时点的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。
        T4 ）、HPG轴（T、E2 ）、免疫（IgG、IgM）相关指标检测                     与正常组比较，模型组大鼠肛温在各时点均显著下
            根据“2.1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取                   降（P＜0.05 或 P＜0.01）。各给药组大鼠灌胃前肛温差

        材与处理。采用ELISA法，按相应试剂盒说明书检测大                         异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，配伍组大
        鼠血清 CRH、ACTH、CORT、T 水平。采用放射免疫法，                    鼠肛温在灌胃第 7、14、21、28 天均显著升高（P＜0.05 或
        按相应试剂盒说明书检测T3、T4、E2水平。采用免疫比浊                       P＜0.01）。与配伍组比较，人参组、蛤蚧组大鼠肛温在
        法，按相应试剂盒说明书检测IgG、IgM水平。根据检测                        灌胃第7天均显著降低（P＜0.05），蛤蚧组大鼠肛温在灌
        结果计算T/E2。                                          胃第 14、21 天均显著降低（P＜0.05）。这说明人参与蛤
        2.6  大鼠肾上腺、甲状腺、睾丸组织病理形态学观察                         蚧配方颗粒配伍对升高肾阳虚模型大鼠肛温具有一定
            根据“2.1”项下分组、造模与给药，根据“2.3”项下取                   的协同作用。结果见表3。


        中国药房    2022年第33卷第11期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11  ·1315 ·
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