Page 76 - 《中国药房》2022年7期
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将各组小鼠从任意象限的中间处头朝桶壁放入水中，记                            BDNF 一抗（稀释度均为 1 ∶ 300）和β-actin 一抗（稀释度
        录其60 s内找到逃生平台的时间（即逃避潜伏期），以评                         为1 ∶ 500），置于4 ℃条件下孵育过夜；次日加入二抗（稀
        价其空间学习能力；如果小鼠在60 s内没有找到逃生平                          释度为1 ∶ 500），于室温条件下孵育1.5 h；滴加ECL工作
        台，则由实验者引导其爬上平台，并停留 10 s 以加深记                        液，并以凝胶成像系统成像。采用Image J v1.8.0软件进
        忆。第6天进行正式实验，逃生平台被置于与训练阶段                            行分析，以 p-CREB 蛋白与 CREB 蛋白灰度值比值表示
        相同的位置上，然后将各组小鼠从平台对侧象限头朝桶                            CREB 蛋白的磷酸化水平，以 BDNF 蛋白与内参β-actin
        壁放入水中，记录各组小鼠的航行轨迹；撤去逃生平台，                           蛋白的灰度值比值表示BDNF蛋白的表达水平。
        将小鼠从原平台对侧象限头朝桶壁放入水中，记录并计                            2.7 统计学方法
        算 120 s 内其穿越平台次数和目标象限停留时间百分                             采用SPSS 22.0软件进行数据分析，计量资料用x±s
        比，以评价其空间记忆能力。                                       表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用
        2.3 取材                                              LSD检验。检验水准α＝0.05。
            Morris水迷宫实验结束后，各组小鼠腹腔注射25％                      3 结果
        乌拉坦溶液进行麻醉并处死，剖取脑组织，部分置于预                            3.1 SZJN对AD模型小鼠学习记忆能力的影响
        冷的磷酸盐缓冲液中暂时保存，备用。另取一部分，使                                与假手术组比较，模型组小鼠航行距离明显增加，
        用 4％多聚甲醛溶液进行固定，随后置于 30％蔗糖溶液                         逃避潜伏期显著延长（P＜0.01），穿越平台次数和目标
        中，于 4 ℃条件下沉降过夜；次日，以冰冻包埋剂包埋，                         象限停留时间百分比显著减少（P＜0.01）；与模型组比
        并置于－80 ℃条件下过夜，然后采用冰冻切片机对脑组                          较，SZJN 各剂量组和盐酸多奈哌齐片组小鼠上述指标
        织进行连续冠状切片（厚度为 10 μm），再置于－80 ℃条                      水平均显著逆转（P＜0.01）。其中，SZJN 高剂量组逆转
        件下冻存，备用。                                            效果最明显，故选择该组小鼠进行后续实验。各组小鼠
        2.4  大鼠脑组织病理学观察                                     定位航行实验轨迹典型图见图 1，SZJN 对 AD 模型小鼠
        2.4.1 HE 染色实验       取“2.3”项下各组（SZJN 低、中剂            学习记忆能力的影响结果见图2。
        量组除外）小鼠脑组织切片依次用95％、80％、70％乙醇
        分别固定5 s，双蒸水润洗3次；以苏木素染液染色30 s，
        1％盐酸乙醇分化液分化5 s，双蒸水润洗3次；再放入氨
        水返蓝液中10 s，双蒸水润洗3次；以伊红染液染色5 s，
        流水冲洗，再分别用 70％、80％、95％乙醇梯度脱水，晾
                                                               A.假手术组            B.模型组         C.盐酸多奈哌齐片组
        干，中性树胶封片，置于显微镜下观察小鼠脑组织病理
        损伤情况并拍照记录。
        2.4.2 Nissl 染色实验      取“2.3”项下各组（SZJN 低、中
        剂量组除外）小鼠脑组织切片置于焦油紫染液中，于
        37 ℃条件浸染 10～30 min，经双蒸水润洗后，放入分化
                                                             D. SZJN低剂量组       E. SZJN中剂量组      F. SZJN高剂量组
        液中分化10～20 s，再以双蒸水润洗，直至在显微镜下观
                                                                  图1   各组小鼠定位航行实验轨迹典型图
        察其背景接近于无色时，以无水乙醇迅速脱水；经二甲
        苯透明、中性树胶封片后，置于显微镜下观察小鼠脑组                            3.2  SZJN对AD模型小鼠脑组织病理学的影响
        织病理损伤情况并拍照记录。                                           由 HE 染色结果（图 3A）可知，假手术组小鼠海马
        2.5 小鼠脑组织中氧化应激指标水平的检测                               CA1 区和皮层组织中神经细胞丰富、排列规律，细胞浆
            取“2.3”项下各组（SZJN 低、中剂量组除外）小鼠的                    和细胞核着色均匀，细胞整体饱满、结构完整、轮廓清
        脑组织，去除嗅球、小脑和脑干部分，保留大脑皮层和海                           晰；模型组小鼠海马CA1区和皮层组织中神经细胞数量
        马组织，合并后制成组织匀浆液，再根据试剂盒说明书                            明显减少、排列杂乱且间隙大，细胞核形状不规则且深
        方法操作，检测小鼠脑组织中SOD、MDA水平。                             染；经SZJN和盐酸多奈哌齐片干预后，小鼠海马CA1区
        2.6  小鼠海马组织中 CREB/BDNF 通路相关蛋白表达                     和皮层组织中神经细胞数量明显增多、排列较为规律，
        水平检测                                                细胞浆和细胞核着色均匀，这提示小鼠脑组织结构得到
            取“2.3”项下各组（SZJN 低、中剂量组除外）小鼠脑                    明显改善。
        组织，剥取海马组织，加入 10 倍量（mL/g）RIPA 裂解液，                       由 Nissl 染色结果（图 3B）可知，假手术组小鼠海马
        提取总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度后，加入上样缓冲                           CA1区和皮层组织中的细胞排列整齐，尼氏体呈虎斑状
        液，煮沸，再进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电                            或点状；模型组小鼠海马CA1区和皮层组织中的尼氏体
        泳，转膜，在室温条件下以 5％BSA 封闭 1 h，以 TBST 缓                  模糊不清，排列疏松，数量减少；经 SZJN 和盐酸多奈哌
        冲 液 清 洗 5 min × 3 次 后 ，分 别 加 入 CREB、p-CREB、         齐片干预后，小鼠海马CA1区和皮层组织中的尼氏体数


        ·838 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 7                                    中国药房    2022年第33卷第7期
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