Page 26 - 《中国药房》2021年22期
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规格，水为超纯水。                                           法操作，用酶标仪测定各组小鼠肝组织中SOD、MDA的
        1.3 实验动物                                            含量。
            本研究所用实验动物为SPF级雄性载脂蛋白E基因                         2.6 小鼠肝组织的病理观察
        缺陷（C57BL/6J-ApoE   －/－ ，以下简称“ApoE    －/－ ”）小鼠 30        取各组小鼠冻存的肝组织适量，用 4％多聚甲醛溶
        只和雄性C57BL/6J小鼠6只，体质量均为（18±2）g，由                     液固定 7 d，经脱水、石蜡包埋后切片（厚度约 5 μm），以
        北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生                            HE 染色，并使用倒置显微镜观察各组小鼠肝组织的病
        产许可证号为 SCXK（京）2016-0011。所有小鼠均在温                     理变化。
        度20～25 ℃、相对湿度40％～70％、每12 h昼夜交替的                     2.7  小鼠肝组织中 PPARα、CPT1A、ACOX1 蛋白表达
        环境下饲养，并自由饮水、进食。普通饲料和高脂饲料                            的测定
        （包括蛋白质20％、碳水化合物35％、脂肪45％）均由新                            采用 Western blot 法进行测定。取各组小鼠冻存的
        疆医科大学动物实验中心提供。本实验所有操作均符                             肝组织适量，置于研钵加液氮研磨，取研磨充分的肝组
        合动物实验伦理要求。                                          织100 mg，加RIPA裂解液1 mL，于冰上匀浆，再于4 ℃下
        2 方法                                                以 12 000 r/min 离心 15 min，取上清液，即得肝组织蛋
        2.1 洋甘菊总黄酮的制备                                       白。采用BCA法测定肝组织的蛋白浓度，加入4×loading

            参考本课题组前期研究所确定的最优提取及纯化                           buffer 蛋白上样缓冲液，于 100 ℃加热 10 min 使蛋白变
        工艺进行操作 ：称取洋甘菊药材粉末适量，加 12 倍量                         性。取变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE分离，采用湿
                     [15]
        （mL/g）的 70％乙醇，加热回流提取 3 次，每次 2 h，合并                  转法转移至 PVDF 膜上，用 5％脱脂奶粉于室温下封闭
        提取液，浓缩；浓缩液经D-101大孔吸附树脂柱，以70％                        1.5 h；用 1×TBST 缓冲液清洗 10 min×3 次，分别加入
        乙醇进行洗脱，收集洗脱液，于60 ℃下旋转蒸发以挥尽                          PPARα、CPT1A、ACOX1、β-actin 一抗（稀释比例均为
        乙 醇 ，干 燥 即 得 洋 甘 菊 总 黄 酮（以 芦 丁 计 含 量 为              1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育过夜；用1×TBST缓冲液清洗10
        56.20％，每1 g总黄酮相当于生药8.62 g）。                         min×3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比例
        2.2  分组、造模与给药                                       为 1 ∶ 5 000），于室温下避光孵育 1 h；用 1×TBST 缓冲液
            将 30 只 ApoE －/－ 小鼠随机分成模型组、阳性对照组                 清洗10 min×3次，加入ECL发光液显影并置于凝胶成像
        （非诺贝特30 mg/kg，给药剂量按人临床常用剂量换算）                       分析仪上成像。采用 Image J v1.8.0 和 Graphpad prism
        和洋甘菊总黄酮低、中、高剂量组（88、176、352 mg/kg，                   7.0软件进行分析、作图，以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）
        给药剂量按人临床常用剂量的 0.5、1、2 倍换算），每组 6                     的灰度值比值作为目标蛋白的表达水平。
        只；另取6只C57BL/6J小鼠作为正常对照组。正常对照                        2.8  统计学方法
        组小鼠用普通饲料喂养，其余各组小鼠均用高脂饲料喂                                采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。实验数
        养8周以复制高脂血症模型；造模同时，各给药组小鼠灌                           据均以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组
        胃相应药液（均以 1％羧甲基纤维素钠溶液为溶剂），正                          间两两比较采用LSD检验。检验水准α＝0.05。
        常对照组和模型组小鼠灌胃 1％羧甲基纤维素钠溶液，                           3 结果
        每次灌胃200 μL，每天1次，连续8周。                               3.1  洋甘菊总黄酮对高脂血症模型小鼠体质量的影响
        2.3  小鼠体质量的称定                                           与给药前比较，各组小鼠给药 8 周后的体质量均有
            分别于给药前和给药 8 周后称定各组小鼠的体质                         升高趋势。与正常对照组比较，模型组小鼠给药8周后
        量，观察其变化趋势。                                          的体质量显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，洋甘菊
        2.4 小鼠血清中血脂和肝功能指标的测定                                总黄酮中、高剂量组和阳性对照组小鼠给药8周后的体
            末次给药后，各组小鼠禁食不禁水，于次日经眼眶                          质量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。
        采血 0.1 mL，血样于室温下放置 30 min 后，在 4 ℃下以                 3.2  洋甘菊总黄酮对高脂血症模型小鼠血脂指标含量
        3 000 r/min离心10 min，分离血清，按照试剂盒说明书方                  的影响
        法操作，用酶标仪测定各组小鼠血清中TG、TC、HDL-C、                           与正常对照组比较，模型组小鼠血清中 TC、TG、
        LDL-C、AST和ALT的含量。                                   LDL-C 含量均显著升高（P＜0.01），HDL-C 含量显著降
        2.5  小鼠肝组织中氧化应激指标的测定                                低（P＜0.01）。与模型组比较，洋甘菊总黄酮各剂量组
            采血后，处死各组小鼠，分离其肝脏，取肝组织于液                         和阳性对照组小鼠血清中 TC、TG、LDL-C 含量均显著
        氮中冻存。取冻存的肝组织适量，按照试剂盒说明书方                            降低（P＜0.01），HDL-C 含量均显著升高（P＜0.01）。与


        ·2708 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 22                                 中国药房    2021年第32卷第22期
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