Page 41 - 《中国药房》2021年21期
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（24±2）℃、相对湿度为 55％～68％，饲养期间大鼠自                       支气管，常规制作石蜡切片（厚度均为 3 μm）后，行常规
        由进食、饮水。本实验严格遵守实验动物福利伦理原                            苏木精-伊红（HE）染色，然后通过显微镜观察肺组织和
        则，实验方案通过广州中医药大学第一附属医院实验动                           支气管的病理形态学变化。
        物伦理委员会审核（伦理审查编号为TCMF1-2020013）。                    2.7  肺组织中基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋
        2 方法与结果                                            白酶抑制剂1（TIMP-1）mRNA表达水平测定
        2.1 苇茎汤煎液的制备                                           采用荧光定量PCR法进行测定。取“2.4”项下冻存
            取苇茎 30 g、薏苡仁 30 g、冬瓜子 24 g、桃仁 9 g，加            的大鼠肺组织，常规解冻后，采用Trizol法提取组织中总
        10倍量（mL/g，下同）水浸泡1 h，然后再煎煮1 h，收集煎                   RNA；检测总RNA的浓度和纯度后，按照逆转录试剂盒
        液；药渣再次加 8 倍量水煎煮 0.5 h，收集煎液；合并 2 次                  说明书方法操作将其逆转录为 cDNA，并以 cDNA 为模
        煎液，浓缩制备成含生药量分别为 8.37、16.74 g/kg 的                  板进行 PCR 扩增。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 10
        药液。                                                min；95 ℃变性 10 s，55 ℃延伸20 s，共40个循环。反应
        2.2 动物分组、造模与给药                                     体系（总体积为 20.0 μL）包括：2× All-in-One qPCR Mix
            将 55 只大鼠先适应性喂养 7 d，然后按随机数字表                    10.0 μL，上、下游引物（2 μmol/L）各 2.0 μL，cDNA 模板
        法随机分为正常组，模型组，苇茎汤低、高剂量组（8.37、                       2.0 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 3.6 μL。以
        16.74 g/kg，以生药量计，分别为 1、2 倍临床等效剂量），                 GAPDH 为内参，采用 2       － Δ Δ Ct  法计算肺组织中 MMP-9、
                                          [16]
        地塞米松组（阳性对照组，0.09 mg/kg） ，每组 11 只。                  TIMP-1 mRNA表达水平。PCR引物由广州四和生物科
        除正常组外，其余各组大鼠均采用香烟联合脂多糖诱导                           技股份有限公司设计并合成，引物序列及扩增产物长度
        的方法复制 AECOPD 模型        [17－18] ：烟熏箱用棉被堵住缝          见表1。
        隙，每次熏烟20支，大鼠每天吸烟2次，每次持续1 h；分                               表1 PCR引物序列与扩增产物长度
        别于烟熏的第 7、14、21 天，于大鼠气管注射脂多糖 1                      Tab 1   PCR primer sequence and amplified product
        mg/kg（注射脂多糖当天不进行烟熏），造模共持续8周。                               length
                                                            基因名称            引物序列                 扩增产物长度，bp
        正常组大鼠于实验第 7、14、21 天气管注射等量 0.9％氯
                                                            MMP-9    上游：5′-GCTGCTCCAACTGCTGTATAA-3′  93
        化钠溶液。造模结束后，每组各取1只大鼠进行病理切                                     下游：5′-TGGTGTCCTCCGATGTAAGA-3′
        片检查：若造模大鼠的支气管周围出现较多慢性炎症细                            TIMP-1   上游：5′-TGGCATCCTCTTGTTGCTATC-3′  103
        胞浸润、部分气道黏膜上皮脱落，肺组织出现肺泡代偿                                     下游：5′-CCTTATAACCAGGTCCGAGTTG-3′
                                                            GAPDH    上游：5′-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3′  98
        性扩张、肺泡壁变薄断裂、肺大泡形成以及肺间隔毛细                                     下游：5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3′
        血管扩张、充血等现象，则表明 AECOPD 模型建立成                        2.8  肺组织中RhoA、DAAM1、HSG蛋白表达水平测定
          [18]
        功 。确定造模成功后，正常组和模型组大鼠灌胃水                                采用Western blot法进行测定，每组选取3只大鼠的
       （10 mL/kg），其余各组大鼠灌胃相应药物（10 mL/kg），                  样本进行实验。取“2.4”项下冻存的大鼠肺组织，常规解
        每天灌胃2次（9：00和15：00各1次），连续灌胃14 d。                    冻后，加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液提取组织中
        2.3  一般情况观察                                        总蛋白，按照BCA试剂盒方法测定总蛋白的浓度后，以
            实验期间观察大鼠的一般情况，包括大鼠的活动、                         95 ℃加热 10 min 使蛋白变性。取变性后总蛋白 40 μg
        精神状况、毛发光泽度、体质量变化等。                                 行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶电压75 V，分离胶
        2.4  取材及处理                                         电压120 V，电泳时间60 min），电泳结束后湿法转移（电
            末次灌胃2 h后，以5％戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔                  流 200 mA，转膜时间 1 h）至聚偏二氟乙烯膜；用 5％脱
        注射麻醉大鼠，于腹主动脉采血。将血液静置 2 h，然                         脂牛奶（以0.5％TBST制备）封闭液封闭20 min后，加入
        后在 4 ℃下以 3 500 r/min 离心 10 min，收集血清，置              TBST 洗膜 3 次、每次 5 min；分别加入 RhoA 一抗（稀释
        于－80 ℃冰箱中保存，备用。采血后，立即处死并解剖                         比例为 1 ∶ 1 000）、DAAM1 一抗（稀释比例为 1 ∶ 5 000）、
        大鼠，取其右肺组织和右支气管，用生理盐水清洗干净；                          HSG 一抗（稀释比例为 1 ∶ 1 000）以及内参β-actin 一抗
        将一部分肺组织和支气管固定在10％甲醛溶液中，将另                          （稀释比例为 1 ∶ 5 000），4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜 3 次、
        一部分肺组织冻存于－80 ℃冰箱中。                                 每次 5 min，加入 HRP 标记的 IgG 二抗（稀释比例均为
        2.5 血清中IL-1β水平测定                                   1 ∶ 2 000），室温孵育1 h；滴加ECL发光液，曝光，采用显
            取“2.4”项下冻存的大鼠血清样品，常规解冻后，采                      影、定影试剂进行显影。采用 Image J 1.8.0 软件分析各
        用ELISA法检测血清中IL-1β水平。具体操作严格按照                       蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带与内参β-actin蛋白
        相应试剂盒说明书方法进行，采用酶标仪进行测定。                            条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。
        2.6  肺组织和支气管的病理形态学观察                               2.9 统计学方法
            取 10％甲醛溶液中固定 24 h 以上的大鼠肺组织和                        采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析。计量资料以


        中国药房    2021年第32卷第21期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 21  ·2595 ·
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