Page 35 - 《中国药房》2021年20期

体生理钠浓度 0.9％换算而得）、NF-κB 信号通路激动 应体系（共20 μL）如下：cDNA模板2 μL，上、下游引物各
剂 + 氯 化 镧 组（3 mmol/L 磷 溶 液 +1 μg/mL LPS +60 0.8 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 µL，无
[10]
μmol/L 氯化镧）、阳性对照组（3 mmol/L 磷溶液+100 RNase水6.4 µL。PCR反应条件如下：95 ℃预变性30 s；
μmol/L PPI [11－12] ）和氯化镧低、中、高浓度组（3 mmol/L磷 95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40个循
溶液+15、30、60 μmol/L氯化镧），每组设置3个复孔。各 环。以β-actin为内参，采用2 －ΔΔCt 法计算细胞中TRAF6、
组用相应浓度的含磷完全培养基培养 6 d 诱导钙化，并 IκBα、BMP-2、SM22α、Runx2 mRNA的表达水平。本实
于第 5 天时加入相应药物，继续培养 2 d（作用时间参考 验所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设
“2.3”项下结果设置）。 计、合成，引物序列及产物长度见表1。
2.5 VSMCs钙化情况的检测 表1 TRAF6等基因的引物序列及产物长度
Tab 1 Primer sequence and product fragment length
2.5.1 茜素红 S 染色 各组细胞用 PBS 洗涤后，加入
of TRAF6 and other genes
4％多聚甲醛溶液 2 mL，在 37 ℃下固定 30 min，弃去多
基因 引物序列（5′→3′） 产物长度，bp
聚甲醛溶液，用PBS洗涤细胞，然后加入1％茜素红S染
GAPDH 上游：GAAGACGGGCGGAGAGAAAC 159
色液（pH 4.2）1 mL，在37 ℃下染色5 min，弃去茜素红S 下游：GCCCAATACGACCAAATCCGT
TRAF6 上游：TACTCATCAGAGAACAGATGCC 135
染色液，用PBS洗涤细胞5次，在倒置荧光显微镜下观察 下游：TGTTCTCTTGTAGGTGGCGT
IκBα 上游：GGGCTATTCTCCCTACCAGC 174
（钙沉积阳性细胞呈红色）。然后使用 10％乙酸溶液对
下游：TCATCATAGGGCAGCTCGTC
钙沉淀物进行脱色，使用多功能酶标仪在420 nm波长处 BMP-2 上游：CCCAGCGTGAAAAGAGAG 133
下游：CGTCCATTGAAAGAGCGT
测定各孔的光密度（OD）。 SM22α 上游：AAGCCTTCTTTCCCCAGACA 129
下游：TGCACTATGATCCACTCCACC
2.5.2 Von Kossa 染色 各组细胞用 PBS 洗涤后，加入 Runx2 上游：GAGTGGACGAGGCAAGAGTT 195
4％多聚甲醛溶液 2 mL，在 37 ℃下固定 30 min，弃去多 下游：GGATGAGGAATGCGCCCTAA
聚甲醛溶液，用PBS洗涤细胞3次后，按Von Kossa染色 2.8 统计学方法
试剂盒说明书方法操作，在倒置荧光显微镜下观察（钙 采用SPSS 22.0和Graphpad Prism 7.0软件对数据进
沉积物呈黑色）。 行统计分析并作图。计量资料以x±s表示，多组间比较
2.6 氯 化 镧 对 细 胞 中 TRAF6、I κ B α 、NF-κ B p65、 采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水
BMP-2、SM22α、Runx2蛋白表达的影响 准α＝0.05。
3 结果
采用 Western blot 法进行检测。收集各组细胞，置
3.1 氯化镧的作用浓度及时间
于 1.5 mL EP 管中，加入 RIPA 裂解液，冰上裂解 5 min，
随着氯化镧浓度的升高，钙化 VSMCs 的存活率呈
于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 min，收集上清液，采用
先增加后降低的趋势。作用1 d时，钙化VSMCs的存活
BCA 蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白煮沸
率在氯化镧浓度为 15 μmol/L 时达到峰值[（155.71±
变性，取变性后蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺
2.02）％]；作用2 d时，钙化VSMCs的存活率在氯化镧浓
凝胶电泳，转膜，以 5％脱脂奶粉室温封闭 1 h，加入相
度为30 μmol/L时达到峰值[（194.23±17.05）％]；作用3 d
应一抗（TRAF6 的稀释比例为 1 ∶ 5 000，IκBα的稀释比
时，钙化VSMCs的存活率在氯化镧浓度为35 μmol/L时
例为 1 ∶ 1 000，NF-κB p65 的稀释比例为 1 ∶ 500，BMP-2、
达到峰值[（144.00±11.09）％]。结果见图 1。本课题组
SM22α、Runx2的稀释比例均为1∶600，β-actin、lamin A/C
最终确定后续实验中氯化镧的低、中、高浓度分别为15、
的稀释比例均为1 ∶ 2 000），于4 ℃下孵育过夜；用TBST
30、60 μmol/L，作用时间为2 d。
缓冲液洗膜后，加入相应二抗（稀释比例均为1 ∶ 2 000）， 250
1 d
于 37 ℃下孵育 1 h；用 TBST 缓冲液洗膜 3 次后，置于红 200 2 d
外激光成像系统下成像。用 Image J v1.8.0 软件进行分 3 d
％ 150
析，计算 TRAF6、IκBα、NF-κB p65、BMP-2、SM22α与内 存活率，
参β-actin的灰度值比值，再与对照组比较表示上述蛋白 100
在细胞质中的表达水平；计算 Runx2、NF-κB p65 与内 50
参 lamin A/C 的灰度值比值，再与对照组比较表示上述 0
0 10 20 30 40 50 60 70
蛋白在细胞核中的表达水平。实验重复3次。 氯化镧浓度，μmol/L
2.7 氯化镧对细胞中 TRAF6、IκBα、BMP-2、SM22α、 图 1 不同浓度氯化镧作用不同时间对钙化 VSMCs 存
Runx2 mRNA表达的影响 活率的影响（x±±s，n＝4）
采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。收集各组细 Fig 1 Effects of different concentration of lanthanum
胞，按相应试剂盒说明书方法操作，提取总RNA并将其 chloride for different time on the survival rate
逆转录为 cDNA。以 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。反 of calcified VSMCs cells（x±±s，n＝4）

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