Page 34 - 《中国药房》2021年20期
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培养箱（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），DMi8 型倒        （IgG）（H+L）二抗（批号A23910）、远红外DyLight 800荧
        置荧光显微镜（德国Leica公司），SpectraMax i3x型多功                 光标记的山羊抗兔 IgG（H+L）二抗（批号 A23920）均购
        能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]，AG-245型分                       自美国 Abbkine 公司；兔源核纤层蛋白 A/C（lamin A/C）
        析天平（瑞士Mettler Toledo公司），3-18K型台式高速冷                 多克隆抗体（批号 10298-1-AP）购自美国 Proteintech 公
        冻离心机（德国Sigma公司），UPHW-Ⅱ-90T型超纯水机                     司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为双
        （四川优普超纯科技有限公司），PowerPac HV Power                    蒸水。
        Supply型基础电泳仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公                        1.3 细胞
        司]，Odyssey CLX型红外激光成像系统（美国LI-COR公                       人 VSMCs 细胞株购自上海钰博生物科技有限
        司）等。                                                公司。
        1.2 主要药品与试剂                                         2 方法
            氯化镧对照品（批号 298182，纯度 99.9％）、脂多糖                  2.1 细胞培养
        （LPS）对照品（NF-κB 信号通路激动剂，批号 L4391，纯
                                                                将VSMCs用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉
        度99％）、焦磷酸钠（PPI）对照品（阳性对照，批号S6422，
                                                            素双抗的高糖DMEM培养基（以下简称“完全培养基”）
        纯度 99.0％～103.0％）均购自德国 Sigma 公司；氯化钠
                                                            培养于37 ℃、5％CO2培养箱中（培养条件下同），待细胞
        （批号10019308，纯度99.8％）购自国药集团化学试剂有
                                                            生长至融合后，将传代第5～7代细胞用于实验。
        限公司；磷酸二氢钠（批号 130310，分析纯）购自无锡市
                                                            2.2 磷溶液的制备
        晶科化工有限公司；磷酸氢二钠（批号 170925，分析纯）
                                                                称取磷酸二氢钠 1.56 g，以水溶解并定容至50 mL，
        购自上海展云化工有限公司；盐酸（批号20140902，分析
                                                            作为 a 溶液。另称取磷酸氢二钠 3.58 g，以水溶解并定
        纯）购自天津市风船化学试剂科技有限公司；高糖
                                                            容至50 mL，作为b溶液。取a溶液9.5 mL和b溶液40.5
        DMEM 培 养 基（批 号 11995-065）、胎 牛 血 清（批 号
                                                            mL，混合，以盐酸调节 pH 至 7.4，高压灭菌 30 min，过
        10099-141）均购自美国 Gibco 公司；0.25％胰酶（批号
                                                            0.22 μm滤膜后，分装，于－20 ℃保存。
        CR2011092）、青霉素-链霉素双抗（批号 CR2011115）均
                                                            2.3  氯化镧作用浓度及时间的筛选
        购自武汉塞维尔生物科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）
                                                                采用MTT法进行筛选。取对数生长期细胞，用PBS
        蛋白定量分析试剂盒（批号 P0012）、RIPA 裂解液（批号
                                                           （pH 7.2～7.4，下同）洗涤后，以完全培养基 2 mL 重悬，
        P0013B）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批号
                                                                                  －1
                                                            调整细胞密度为1×10 mL ，以每孔100 µL接种于96孔
                                                                              4
        C1006）均购自上海碧云天生物技术有限公司；总 RNA
                                                            板中，培养 24 h 后，将细胞分为对照组（1 mmol/L 磷溶
        提取试剂盒（批号 DP419）购自天根生化科技（北京）有
                                                            液）和不同浓度氯化镧组（3 mmol/L 磷溶液+0、15、20、
        限公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit（批号 FSQ-101）、
                                                            25、30、35、40、45、50、55、60、65 μmol/L氯化镧），每组设
        SYBR Green Realtime PCR Master Mix（批号 QPK-201）
                                                            置4个复孔。对照组和各氯化镧组加入相应磷溶液，持
        均购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；茜素红S染色
                                                            续培养6 d诱导钙化，分别于第4、5、6天时加入相应浓度
        液（批号 G1452）、Von Kossa 染色试剂盒（批号 G3282）、
                                                            氯化镧溶液（以水为溶剂），继续培养。于第7天时，弃去
        兔源β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（批号 K101527P）
                                                            各孔培养基，加入新鲜完全培养基，再加入 5 mg/mL 的
        均购自北京索莱宝科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）
        （批号PM5090-10）购自北京酷来博科技有限公司；细胞                       MTT溶液20 µL，继续培养4 h；弃去培养基，加入二甲基
        核和细胞质提取试剂盒（批号78833）购自赛默飞世尔科                         亚砜 150 µL，轻轻振荡 10 min，用酶标仪在 490 nm 波长
        技有限公司；5×loading buffer（十二烷基硫酸钠-聚丙烯                  处测定各孔的吸光度（A），按如下公式计算细胞的存活
        酰胺凝胶电泳）蛋白上样缓冲液（批号103025）购自北京                        率：存活率（％）＝氯化镧组A值/对照组A值×100％。选
        普莱利基因技术有限公司；兔源肿瘤坏死因子受体相关                            择细胞存活率较高组别对应的浓度和时间作为后续实
        蛋白6（TRAF6）单克隆抗体（批号ab40675）、兔源核因子                    验氯化镧的作用浓度和时间。实验重复3次。
        κB抑制蛋白α（IκBα）单克隆抗体（批号ab32518）均购自                    2.4 分组、造模与给药
        英国 Abcam 公司；小鼠源 NF-κB p65 单克隆抗体（批号                      取对数生长期细胞，用 PBS 洗涤后，以完全培养基
                                                                                         4
                                                                                             －1
        6956）购自美国 Cell Signaling Technology 公司；小鼠源          2 mL 重悬，调整细胞密度为 1×10 mL ，以每孔 100 µL
        骨形态发生蛋白2（BMP-2）单克隆抗体（批号SC-137087）、                  接种于 96 孔板中，培养 24 h 后，将细胞分为对照组（1
        小鼠源平滑肌22α（SM22α）单克隆抗体（批号SC-53932）、                  mmol/L 磷溶液）、氯化镧高浓度对照组（1 mmol/L 磷溶
        小鼠源 Runt 相关转录因子 2（Runx2）单克隆抗体（批号                    液+60 μmol/L氯化镧，氯化镧浓度参考“2.3”项下结果设
        SC-101145）均购自北京安诺伦生物科技有限公司；远红                       置，下同）、模型组（3 mmol/L 磷溶液）、氯化钠组（3
        外 DyLight 800 荧光标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白 G                     mmol/L 磷溶液+180 μmol/L 氯化钠，氯化钠浓度根据人


        ·2460 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 20                                 中国药房    2021年第32卷第20期
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