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品中有效成分芹菜素的含量为0.782 1 mg/g。 孵育 10 min；再将切片经二氨基联苯胺（DBA）显色、梯
2.2 分组、造模与给药 度乙醇脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封固后，置于显
将 72 只 KM 小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对 微镜下观察（组织切片中目标蛋白阳性表达处呈黄褐
照组（秋水仙碱 0.2 mg/kg，按人临床使用剂量的等效剂 色）。每张切片随机选取5个视野进行拍照，采用Image
量设定）和卷拳地钱总黄酮高、中、低剂量组（300、150、 J2×（2.1.4.7版）软件进行扫描，分析5个视野下图片的光
75 mg/kg，剂量参考文献[8]及前期预实验结果设定），每 密度值，并计算其平均光密度作为目标蛋白的表达水
组12只。空白组小鼠在背部皮下注射花生油，其余各组 平，其值越大表明蛋白的表达水平越高。各组均选择 8
小鼠均于背部皮下注射25％四氯化碳-花生油溶液以复 个组织样本进行测定，最后以各目标蛋白表达水平的平
制肝纤维化模型，注射体积均为 2 mL/kg ，每 3 天注射 1 均值进行统计学分析。
[12]
次，连续 10 周 。在造模的同时，空白组和模型组小鼠 2.8 肝组织中 TGF-β/Smad 信号通路相关基因 mRNA
灌胃水，其余各给药组小鼠灌胃相应药物（均以水溶 表达水平的测定
解），灌胃体积均为20 mL/kg，每天1次，连续10周。 采用逆转录（RT）-PCR法进行测定。称取冻存肝组
2.3 样本取材及处理 织约 15 mg，采用 Trizol 法提取细胞中总 RNA；在验证
实验结束前 1 天，小鼠禁食不禁水 12 h。末次灌胃 RNA的浓度及纯度后，按照cDNA第一链合成试剂盒方
1 h 后，摘小鼠眼球取血，将血液在 4 ℃静置 2 h 后，以 法合成 cDNA。然后以 cDNA 为模板，采用两步法进行
3 000 r/min 离心 10 min，取上层血清，置于－80 ℃冰箱 PCR扩增。扩增条件为：95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，
中保存，备用。将小鼠处死，取出其肝组织，分批剪取适 然后以 72 ℃延伸 10 min，共 30 个循环。反应体系总体
量组织装入冻存管并迅速浸入液氮中，然后放入－80 ℃ 积为20 μL。取5 μL PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳
冰箱中保存，备用；另取一部分肝脏左叶浸入4％多聚甲 （电压为100 V，电泳时间为45 min）后，用凝胶成像系统
醛溶液中固定，备用。 拍照。以Image J2×（2.1.4.7版）软件测定条带灰度值，以
2.4 血清中ALT、AST水平测定 目的基因条带灰度值与内参基因GAPDH条带灰度值的
取冻存的血清，常温解冻后，采用微板法测定各组 百分比值表示目的基因的 mRNA 表达水平。各组均选
小鼠血清中 ALT、AST 水平，具体操作按照相应试剂盒 择 3 个组织样本进行测定。RT-PCR 引物序列及产物长
说明书方法进行。 度见表1。
2.5 肝组织病理学观察 表1 RT-PCR引物序列及产物长度
取 4％多聚甲醛溶液中固定的肝组织，常规制备石 Tab l Primer sequence and product length for RT-
蜡切片后（厚度为 5 μm），分别进行常规苏木精-伊红 PCR
（HE）染色和 Masson 染色，然后在倒置显微镜下观察各 基因 引物序列 产物长度，bp
上游：5′-CATCCGTGGCCAGATCCTGT-3′ 487
TGF-β1
组小鼠肝组织的病理学改变情况。 下游：5′-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3′
2.6 肝组织中COL-ⅠⅠ、COL-ⅢⅢ、TGF-β1水平测定 Smad2 上游：5′-GCTCTCCGGCTGAACTGTCT-3′ 377
下游：5′-GTGCCAGCCGTATCTCTGGT-3′
取冻存的肝组织，室温解冻后，称取 1 g 组织剪碎，
Smad4 上游：5′-TGCATGCCGAGGAGAGTCAG-3′ 541
然后在冰水浴中研磨制成10％组织匀浆液；将匀浆液以 下游：5′-ACAGTGAAGCAGCAGGCAGA-3′
2 500 r/min离心10 min，收集上清液，采用ELISA法检测 Smad7 上游：5′-TGCGAGGAGGTGGTGTGTTT-3′ 379
下游：5′-CCTACAGTGGCTCCCGAGTG-3′
各组小鼠肝组织上清液中 COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β 1水 GAPDH 上游：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′ 496
平，具体操作按照相应试剂盒说明书方法进行。 下游：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′
2.7 肝组织中α-SMA 蛋白及 TGF-β/Smad 信号通路相 2.9 统计学方法
关蛋白表达水平的测定 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。数据均
采用免疫组织化学法（ICH）进行测定。取 4％多聚 以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
甲醛溶液中固定的肝组织，常规制作石蜡切片（厚度为 两比较采用SNΚ检验。检验水准α＝0.05。
5 μm）并进行脱蜡、H2O2灭活后，室温孵育20 min。将切 3 结果
片置于微波炉中进行抗原修复10 min，取出，以5％牛血 3.1 小鼠血清中ALT、AST水平测定结果
清封闭，然后分别加入α-SMA、TGF-β 1、Smad2、Smad4、 与空白组比较，模型组小鼠血清中 ALT、AST 水平
Smad7 的兔单克隆抗体（稀释比例均为 1 ∶ 100），4 ℃孵 均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组和卷
育过夜；然后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 3 次、每次 5 拳地钱总黄酮高剂量组小鼠血清中ALT、AST水平以及
min，每张切片滴加即用型 MaxVison 试剂 50 μL，室温 卷拳地钱总黄酮中剂量组小鼠血清中 ALT 水平均显著
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中国药房 2021年第32卷第19期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 19 ·2365 ·
