Page 65 - 《中国药房》2021年10期
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液,每天 1 次,连续 5 周,以复制小鼠苦寒泻下脾虚模 s,共40个循环。以GAPDH为内参基因,采用2 -ΔΔCt 法计
型 [11] ;空白组小鼠灌胃等体积生理盐水。造模完成 算各目的基因mRNA的相对表达量(以空白对照组的值
后,党参多糖高、中、低剂量组小鼠分别按 1.6、0.8、0.4 为 1)。引物序列及扩增产物长度见表 1[引物序列由本
g/(kg·d)灌胃党参多糖(给药体积为 20 mL/kg,以水为 课题组采用 Primer premier 5.0 软件自行设计,由生工生
溶剂),给药剂量参考党参日用剂量(30 g)并按人与动物 物工程(上海)股份有限公司合成]。
[1]
体表面积换算剂量公式折算 ,分别为临床成人等效剂 表1 各基因引物序列及产物扩增长度
量的2、1、0.5倍;四君子汤组小鼠按30 g/(kg·d)(以生药 Tab 1 Primer sequence and amplification length of
[12]
总量计)灌胃四君子汤 ,为成人临床等效剂量;空白组 each gene
和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。每天下午给药 1 基因名称 引物序列(5′→3′) 扩增产物长度,bp
次,连续给药6周。在给药期间,除空白组外,其余各组 Claudin 正向引物:GGCCACAGCATGGTATGGAA 158
反向引物:GGGGACAGGAGCAGGAAAGT
小鼠每天上午均继续按0.4 g/d维持灌胃番泻叶溶液,每
Occludin 正向引物:GCCTCCACCCCCATCTGACT 252
天1次。 反向引物:TTGCCCTTTCCTGCTTTCCC
2.3 小鼠体质量测定与行为学观察 GAPDH 正向引物:CGGACACATTGGGGGTAG 122
反向引物:GGCTGCCCAGAACATCAT
实验期间,每 3 天以及在给药结束后称定小鼠体质
2.8 小鼠结肠组织中Claudin、Occludin蛋白表达测定
量,并每天观察其一般体征。参考《中药新药临床研究
采用 Western blot 法进行检测。取小鼠结肠组织适
指导原则》的脾虚标准,制订本研究中脾虚动物模型的
量,加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白提
标准为:(1)大便溏稀;(2)体质量减轻或增长缓慢;(3)
取液,用高速组织研磨仪匀浆,然后在 4 ℃下以 12 850
蜷缩聚堆;(4)神态萎靡,毛色枯槁;(5)弓背;(6)易疲
r/min 离心 5 min,取上清液,按照 BCA 蛋白定量试剂盒
劳。其中,前3项为主症,后3项为次症,具备2项主症或
方法测定总蛋白含量。将总蛋白于 100 ℃加热变性 10
者 1 项主症兼 2 项次症者,即可认定脾虚模型构建成
[13]
功 。 min 后,取变性蛋白样品 30 μg 进行十二烷基硫酸钠-聚
丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶层80 V恒压、分离胶层120 V
2.4 小鼠血清中D-木糖含量测定
末次给药 12 h 后,各组小鼠均灌胃 6%D-木糖溶液 恒压),然后以0.3 A恒流转移至PVDF膜上。用5%脱脂
10 mL/kg;1 h后,摘眼球取血1.5 mL,迅速吸取全血10 μL 牛奶室温封闭1 h,分别加入Claudin、Occludin、β-actin 抗
用于红细胞计数。剩余血样于室温静置 90 min 后,以 体(稀释度分别为1 ∶ 8 000、1 ∶ 6 000、1 ∶ 2 000),于4 ℃孵
育过夜;TBST 溶液清洗 5 min×3 次,加入辣根过氧化物
3 000 r/min离心10 min,分离上层血清。取部分血清,按
照D-木糖试剂盒说明书要求,采用间苯三酚显色法于紫 酶标记的IgG二抗(稀释度为1∶20 000),室温下孵育1 h;
外-可见分光光度计下测定小鼠血清中D-木糖含量。 TBST 溶液清洗 5 min×3 次,经超敏 ECL 化学发光液显
2.5 小鼠全血中红细胞计数测定 色后,于凝胶成像仪上成像。使用 Image Lab 1.6.0 软件
取“2.4”项下全血 10 μL,以生理盐水稀释 10 000 倍 分析条带灰度值,以目标蛋白与内参蛋白(β-actin)条带
至 100 mL,取 1 或 2 滴稀释血样置于载有干燥盖玻片的 的灰度值比值作为目标蛋白的表达水平。
红细胞计数板的一端,于倒置荧光显微镜下采用细胞计 2.9 统计学方法
数器进行小鼠全血红细胞计数。 利用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。计量资
2.6 小鼠血清中生物学指标含量测定 料以 x±s 表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间
取“2.4”项下血清适量,按照试剂盒说明书方法操 两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异具有统计学
作,采用ELISA法以酶标仪测定各组小鼠血清中胃肠激 意义。
素(GAS、MTL、SS、VIP)、AMS、IgG、IgM、LPS含量。 3 结果
2.7 小鼠结肠组织中 Claudin、Occludin mRNA 表达 3.1 党参多糖对脾虚模型小鼠体质量和行为学的影响
测定 实验期间,空白组小鼠活动正常,背毛光泽,反应灵
采用qRT-PCR法进行检测。取血后将小鼠处死,取 敏,粪便正常。模型组小鼠自灌胃番泻叶溶液进行造模
其结肠,液氮速冻后,按照 Trizol 法提取结肠组织总 后,其粪便就时软时溏;后期出现了体质量增长缓慢、扎
RNA,检验其纯度后,反转录合成 cDNA,并以 cDNA 为 堆、懒动现象,且出现了肛周污秽和背毛稀疏、无光泽等
模板进行PCR扩增。反应体系(共20 μL)包括cDNA 模 脾虚症状,提示脾虚小鼠模型造模成功。给药6周后,各
板2 μL,上、下游引物各0.8 μL,TB Green Premix Ex Taq 给药组小鼠的活动及背毛情况均恢复正常。与空白组
Ⅱ10 μL,灭菌水 6.4 μL。采用两步法进行扩增反应,扩 比较,模型组小鼠体质量显著降低(P<0.05);与模型组
增条件为 95 ℃预变性 30 s;95 ℃变性 5 s,60 ℃延伸 31 比较,党参多糖高剂量组小鼠体质量显著升高(P<
中国药房 2021年第32卷第10期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 10 ·1211 ·