Page 65 - 《中国药房》2021年10期
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液，每天 1 次，连续 5 周，以复制小鼠苦寒泻下脾虚模                       s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2                 －ΔΔCt 法计
        型 [11] ；空白组小鼠灌胃等体积生理盐水。造模完成                        算各目的基因mRNA的相对表达量（以空白对照组的值
        后，党参多糖高、中、低剂量组小鼠分别按 1.6、0.8、0.4                    为 1）。引物序列及扩增产物长度见表 1[引物序列由本
        g/（kg·d）灌胃党参多糖（给药体积为 20 mL/kg，以水为                  课题组采用 Primer premier 5.0 软件自行设计，由生工生
        溶剂），给药剂量参考党参日用剂量（30 g）并按人与动物                       物工程（上海）股份有限公司合成]。
                                 [1]
        体表面积换算剂量公式折算 ，分别为临床成人等效剂                                   表1 各基因引物序列及产物扩增长度
        量的2、1、0.5倍；四君子汤组小鼠按30 g/（kg·d）（以生药                 Tab 1 Primer sequence and amplification length of
                           [12]
        总量计）灌胃四君子汤 ，为成人临床等效剂量；空白组                                  each gene
        和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。每天下午给药 1                            基因名称            引物序列（5′→3′）           扩增产物长度，bp
        次，连续给药6周。在给药期间，除空白组外，其余各组                           Claudin    正向引物：GGCCACAGCATGGTATGGAA     158
                                                                       反向引物：GGGGACAGGAGCAGGAAAGT
        小鼠每天上午均继续按0.4 g/d维持灌胃番泻叶溶液，每
                                                            Occludin   正向引物：GCCTCCACCCCCATCTGACT     252
        天1次。                                                           反向引物：TTGCCCTTTCCTGCTTTCCC
        2.3 小鼠体质量测定与行为学观察                                   GAPDH      正向引物：CGGACACATTGGGGGTAG       122
                                                                       反向引物：GGCTGCCCAGAACATCAT
            实验期间，每 3 天以及在给药结束后称定小鼠体质
                                                           2.8 小鼠结肠组织中Claudin、Occludin蛋白表达测定
        量，并每天观察其一般体征。参考《中药新药临床研究
                                                               采用 Western blot 法进行检测。取小鼠结肠组织适
        指导原则》的脾虚标准，制订本研究中脾虚动物模型的
                                                           量，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白提
        标准为：（1）大便溏稀；（2）体质量减轻或增长缓慢；（3）
                                                           取液，用高速组织研磨仪匀浆，然后在 4 ℃下以 12 850
        蜷缩聚堆；（4）神态萎靡，毛色枯槁；（5）弓背；（6）易疲
                                                           r/min 离心 5 min，取上清液，按照 BCA 蛋白定量试剂盒
        劳。其中，前3项为主症，后3项为次症，具备2项主症或
                                                           方法测定总蛋白含量。将总蛋白于 100 ℃加热变性 10
        者 1 项主症兼 2 项次症者，即可认定脾虚模型构建成
          [13]
        功 。                                                min 后，取变性蛋白样品 30 μg 进行十二烷基硫酸钠-聚
                                                           丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶层80 V恒压、分离胶层120 V
        2.4  小鼠血清中D-木糖含量测定
            末次给药 12 h 后，各组小鼠均灌胃 6％D-木糖溶液                   恒压），然后以0.3 A恒流转移至PVDF膜上。用5％脱脂
        10 mL/kg；1 h后，摘眼球取血1.5 mL，迅速吸取全血10 μL              牛奶室温封闭1 h，分别加入Claudin、Occludin、β-actin 抗
        用于红细胞计数。剩余血样于室温静置 90 min 后，以                       体（稀释度分别为1 ∶ 8 000、1 ∶ 6 000、1 ∶ 2 000），于4 ℃孵
                                                           育过夜；TBST 溶液清洗 5 min×3 次，加入辣根过氧化物
        3 000 r/min离心10 min，分离上层血清。取部分血清，按
        照D-木糖试剂盒说明书要求，采用间苯三酚显色法于紫                          酶标记的IgG二抗（稀释度为1∶20 000），室温下孵育1 h；
        外-可见分光光度计下测定小鼠血清中D-木糖含量。                           TBST 溶液清洗 5 min×3 次，经超敏 ECL 化学发光液显
        2.5  小鼠全血中红细胞计数测定                                  色后，于凝胶成像仪上成像。使用 Image Lab 1.6.0 软件
            取“2.4”项下全血 10 μL，以生理盐水稀释 10 000 倍              分析条带灰度值，以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）条带
        至 100 mL，取 1 或 2 滴稀释血样置于载有干燥盖玻片的                   的灰度值比值作为目标蛋白的表达水平。
        红细胞计数板的一端，于倒置荧光显微镜下采用细胞计                           2.9  统计学方法
        数器进行小鼠全血红细胞计数。                                         利用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。计量资
        2.6  小鼠血清中生物学指标含量测定                                料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
            取“2.4”项下血清适量，按照试剂盒说明书方法操                       两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异具有统计学
        作，采用ELISA法以酶标仪测定各组小鼠血清中胃肠激                         意义。
        素（GAS、MTL、SS、VIP）、AMS、IgG、IgM、LPS含量。               3 结果
        2.7  小鼠结肠组织中 Claudin、Occludin mRNA 表达              3.1 党参多糖对脾虚模型小鼠体质量和行为学的影响
        测定                                                     实验期间，空白组小鼠活动正常，背毛光泽，反应灵
            采用qRT-PCR法进行检测。取血后将小鼠处死，取                      敏，粪便正常。模型组小鼠自灌胃番泻叶溶液进行造模
        其结肠，液氮速冻后，按照 Trizol 法提取结肠组织总                       后，其粪便就时软时溏；后期出现了体质量增长缓慢、扎
        RNA，检验其纯度后，反转录合成 cDNA，并以 cDNA 为                    堆、懒动现象，且出现了肛周污秽和背毛稀疏、无光泽等
        模板进行PCR扩增。反应体系（共20 μL）包括cDNA 模                     脾虚症状，提示脾虚小鼠模型造模成功。给药6周后，各
        板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，TB Green Premix Ex Taq         给药组小鼠的活动及背毛情况均恢复正常。与空白组
        Ⅱ10 μL，灭菌水 6.4 μL。采用两步法进行扩增反应，扩                    比较，模型组小鼠体质量显著降低（P＜0.05）；与模型组
        增条件为 95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，60 ℃延伸 31             比较，党参多糖高剂量组小鼠体质量显著升高（P＜


        中国药房    2021年第32卷第10期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 10  ·1211 ·
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