Page 51 - 《中国药房》2021年8期
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ABclonal Technology 公 司 ；cDNA 合 成 试 剂 盒（批 号        度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后切片（厚度
        ED37958r）、荧光定量-PCR 试剂盒（批号 ED47823r）均               约 5 μm）。取上述切片脱蜡至水，加入 1％天狼猩红饱
        购自广州晶欣生物科技有限公司；PCR实验中各基因引                          和苦味酸溶液染色 1 h；用水冲洗 5 min，加入苏木精试
        物序列均由赛默飞世尔科技（中国）有限公司设计、合                           剂复染5 min；用水冲洗5 min，然后经乙醇逐级脱水、二
        成；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸                            甲苯透明后，用中性树脂封片。采用生物显微镜观察小
        馏水。                                                鼠血管内皮胶原纤维的形成情况（镜下，胶原纤维染色
        1.3 动物                                             后呈红色，细胞核呈蓝色）。
            SPF 级 ApoE  －/－ 小鼠 60 只，雄性，2 月龄，体质量            2.5 小鼠血清中iNOS 、CD206含量检测
        15～25 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物生                           采用 ELISA 法进行检测。取“2.2”项下血清样品适
        产许可证号为 SCXK（粤）2018-0034。所有动物均饲养                    量，严格按照相应试剂盒说明书方法操作，使用酶标仪
        于温度（22±2）℃、相对湿度 50％的动物房内。饲养期                       检测各组小鼠血清中iNOS、CD206的含量。
        间自由摄食、饮水，适应性喂养1周后用于实验。本研究                          2.6  小鼠主动脉中 M1、M2 型巨噬细胞极化相关因子
        得到了广州中医药大学动物实验伦理委员会的批准。                            mRNA表达水平检测
        2 方法                                                   采用实时荧光定量-PCR法进行检测。其中，M1型
        2.1 黄连解毒汤的制备                                       巨噬细胞分型相关标志物和细胞因子有白细胞介素 1β
            按黄连解毒汤的药材组成称取相应药材（黄连9 g、                       （IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和iNOS；M2型巨噬细
        黄芩 6 g、黄柏 6 g、栀子 9 g），先以 8 倍量（mL/g）水浸泡             胞分型相关标志物和细胞因子有IL-10、类几丁质酶3样
        1 h，然后煮沸，再改为文火煎煮 30 min，趁热用纱布滤                     分子（YM1）和炎症区域分子 1（Fizz1）。取小鼠胸主动
        过，收集滤液；待滤液自然滴尽后，药渣再次加6倍量水
                                                           脉组织，采用 TRIzol法提取总 RNA，鉴定其浓度和纯度
       （mL/g）煮沸，然后改文火再煎煮 30 min，趁热用纱布滤                     后，将总RNA反转录成cDNA，并以cDNA为模板，进行
        过，收集滤液。合并2次滤液，并加热浓缩成2 g/mL（以
                                                           PCR扩增。反应体系（共20 μL）含上、下游引物各2 μL，
        生药总量计）的药液，分装后置于4 ℃冰箱中保存，于灌
                                                           cDNA 模板 4 μL，SYBR 荧光染料 10 μL，无核酸酶水 2
        胃前0.5 h取出并加热。
                                                           μL；PCR 反应条件为 95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，
        2.2  分组、造模与给药
                                                           55 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 15 s，共 40 个循环；最后再以
            将 60 只 ApoE －/－ 小鼠随机分为空白对照组、模型
                                                           80 ℃再延伸 15 s 。以 GAPDH 基因为内参，采用 2             －ΔΔCt
                                                                          [12]
        组、辛伐他汀组[阳性对照，5 mg/（kg·d），剂量参考文
                                                           法计算各目标基因 mRNA 的表达水平。各基因的 PCR
        献[11]设置]和黄连解毒汤低、中、高剂量组[5、10、20
                                                           引物序列及产物长度见表1。
        g/（kg·d），以生药总量计，剂量参考文献[12]设置]，每组
                                                                 表1    各基因的PCR引物序列及产物长度
        10只。空白对照组小鼠予以常规饲料，其余5组小鼠均
                                                           Tab 1 PCR primer sequence and product length of
        采用高脂饲料[由基础饲料（81％）、猪油（15％）、蛋黄粉
                                                                   each gene
       （2％）、胆固醇（1.5％）和 0.5％胆酸钠（1.5％）组成]喂养
                                                             基因  上游引物（5′→3′）         下游引物（5′→3′）     产物长度，bp
        12 周以建立 AS 模型（以小鼠血管内皮损伤且内皮下可
                                                            IL-1β  TTCATCTTTGAAGAAGAGCCCAT  TCGGAGCCTGTAGTGCAGTT  102
                                           [13]
        见厚厚一层胶原纤维为模型复制成功） 。造模结束                             TNF-α  GTGATCGGTCCCCAAAGG  GGTGGTTTGCTACGACGTG  136
        后，各药物组小鼠灌胃相应药液（辛伐他汀组灌胃体积为                           iNOS  TCCATGACTCCCAGCACA  CCATCTCCTGCATTTCTTCC  108
                                                            IL-10  CCTTAATGCAGGACTTTAAGGGTTA ACCCAGGGAATTCAAATGCT  104
        0.5 mL/kg，黄连解毒汤低、中、高剂量灌胃体积分别为2.5、                   YM1  CTGAACCTCGGGGGTTAGTA  GAAGGAAGGAAAGGAGGGAG  150
        5、10 mL/kg），空白对照组和模型组小鼠灌胃生理盐水                       Fizz1  CAACCTGTTCCCTTCTCA  ACCAGTAGCAGTCATCCC  215
       （0.5 mL/kg）。每天给药1次，连续4周。                             GAPDH TCCCTGTCAAGCAGTATCC  TCCTCCTTGGCTTTGTCTC  102
        2.3 小鼠血清中血脂指标含量检测                                  2.7 统计学方法
            于末次给药后 24 h，小鼠摘眼球取血 3 mL，静置 1                      采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
        h，然后以3 000 r/min离心10 min，收集上层血清。严格                 料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
        按照相应试剂盒说明书方法操作，采用全自动生化分析                           两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异具有统计学
        仪检测各组小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。                     意义。
        2.4  小鼠主动脉血管内皮胶原纤维观察                               3 结果
            采用天狼猩红染色法进行观察。取血后，腹腔注射                         3.1  黄连解毒汤对AS模型小鼠血清中血脂指标含量的
        3％戊巴比妥溶液对小鼠进行麻醉，然后取其胸主动脉                           影响
        组织适量，放入4％多聚甲醛溶液中固定过夜，经常规梯                              与空白对照组比较，模型组小鼠血清中 TC、TG、


        中国药房    2021年第32卷第8期                                              China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 8  ·941 ·
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