Page 27 - 《中国药房》2021年8期
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染色程度对肾小管损伤和肾小球硬化情况分别进行评                            3 结果
        分：正常，记为0分；轻度染色（染色面积≤25％），记为1                       3.1  丹参多酚酸盐对RIF模型大鼠血清中Scr、BUN水
        分；中度染色（染色面积＞25％～50％），记为 2 分；重度                     平和尿液中24 h UPro水平的影响
        染色（染色面积＞50％～75％），记为 3 分；极重度染色                          与正常组比较，模型组大鼠血清中Scr、BUN水平和
                                   [1]
       （染色面积＞75％），记为 4 分 。取平均值作为评价                         尿液中24 h UPro水平均显著升高（P＜0.05）。与模型组
        结果。                                                比较，各给药组大鼠血清中 Scr、BUN 水平和尿液中 24
        2.4.2 Masson 染色    另取上述石蜡切片经二甲苯脱蜡                  h UPro 水平均显著降低（P＜0.05），而各给药组血清中
        后，按Masson试剂盒说明书方法进行染色，其中肌纤维                        上述指标水平组间比较差异均无统计学意义（P＞
        呈红色，胶原纤维呈蓝色。采用Image J v1.8.0软件测定                   0.05）。各组大鼠血清中 Scr、BUN 水平和尿液中 24 h
        每个视野中蓝色阳性染色面积占总面积的百分比（简称                           UPro水平检测结果见表1。
       “阳性染色面积百分比”），以此评价肾小管萎缩及肾间                           表1    各组大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro
                    [1]
        质纤维化水平 。                                                 水平检测结果（x±±s，n＝10）
        2.5  大鼠肾组织中 Wnt5a、Wnt5b、β-catenin 蛋白表达             Tab 1 Serum levels of Scr and BUN and urine level of
        水平检测                                                      24 h UPro of rats in each group（x±±s，n＝10）
        2.5.1  免疫组化法      取石蜡切片经脱蜡、水化后，H2O2                 组别          剂量，mg/kg  Scr，μmol/L  BUN，mmol/L  24 h UPro，mg/L
                                                            正常组                 135.00±15.00  5.44±0.30  4.56±0.19
        封闭，然后以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，以柠檬酸盐缓冲
                                                            模型组                 243.60±11.63 ＊  7.78±0.61 ＊  6.26±0.24 ＊
        液于 121 ℃下热修复，再滴加山羊血清封闭液，室温孵                         氯沙坦组           9    136.80±12.51 #  5.64±0.65 #  5.22±0.31 #
        育 1 h 后倾去液体，分别滴加 Wnt5a、Wnt5b、β-catenin 一            丹参多酚酸盐低剂量组    18    143.40±14.21 #  5.72±0.91 #  4.68±0.30 #
                                                            丹参多酚酸盐高剂量组    36    138.80±14.96 #  5.50±0.74 #  4.86±0.22 #
        抗（稀释比例均为1 ∶ 100），4 ℃孵育过夜；滴加HRP标记
                                                                           ＊
                                                               注：与正常组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
                                                                                             #
        的羊抗兔IgG二抗（稀释比例均为1 ∶ 100），37 ℃孵育20
                                                               Note：vs. normal group， P＜0.05；vs. model group，P＜0.05
                                                                               ＊
                                                                                                  #
        min。DAB显色，水冲洗，苏木精复染1～2 min；1％盐酸
                                                           3.2  丹参多酚酸盐对 RIF 模型大鼠肾脏病理组织学的
        乙醇溶液分化，水再次冲洗；然后经常规脱水、透明、封
                                                           影响
        片后置于显微镜下检示（目标蛋白会被染成棕黄色），每
                                                           3.2.1 HE染色结果        病理取材时可见模型组大鼠肾脏
        组选取 3 张切片，采用 Image-Pro Plus 6.0 软件测定每个
                                                           代偿性增大，表面存在凸起。HE染色结果显示：正常组
        视野中细胞的积分光密度（IOD）值，取平均值作为检测
                                                           大鼠肾小管结构排列整齐，肾小球形态规则，无系膜增
        结果。
                                                           生，间质正常，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠可见系膜
        2.5.2 Western blot法  取肾组织，用冷PBS洗去血污后               增生，肾小管扩张或萎缩，肾小球硬化且形态不规则，球
        剪成小块置于匀浆管中，加入 10 倍体积的 RIPA 裂解液                     囊粘连，纤维化组织增多，间质增宽，可见炎性细胞浸
        彻底匀浆，冰浴 30 min 后，以 12 000 r/min 离心 10 min，         润；丹参多酚酸盐低、高剂量组和氯沙坦组大鼠肾小管
        收集上清，即为总蛋白溶液。用 BCA 蛋白浓度测定试                         扩张或萎缩减轻，炎性细胞减少。与正常组比较，模型
        剂盒定量分析后，加入上样缓冲液，沸水浴 15 min 使蛋                      组大鼠肾小管损伤评分、肾小球硬化评分均显著升高
        白变性。取变性后蛋白适量，进行 SDS-PAGE（浓缩胶                       （P＜0.05）。与模型组比较，各给药组大鼠肾小管损伤
        电压75 V，分离胶电压120 V），然后以300 mA恒流电转                   评分、肾小球硬化评分均显著下降（P＜0.05），而各给药
        30 min至聚偏二氟乙烯膜上；5％脱脂牛奶室温封闭1 h                      组上述指标评分组间比较差异均无统计学意义（P＞
        后，加入Wnt5a、Wnt5b、β-catenin、β-actin一抗（稀释比例           0.05）。各组大鼠肾组织 HE 染色显微图见图 1，肾小管
        均为1∶3 000），4 ℃孵育过夜；TBST漂洗5 min×3次，加入               损伤评分、肾小球硬化评分结果见表2。
        HRP标记的羊抗兔IgG二抗（稀释比例均为1∶3 000），室                    3.2.2 Masson 染色结果      正常组大鼠肾间质可见少量
        温孵育 30 min；TBST 漂洗 5 min×3 次，使用 ECL 试剂盒            纤维化；模型组大鼠肾间质纤维化程度明显增加；氯沙
        显色，于化学发光成像仪上成像，然后采用Image J v1.8.0                  坦组和丹参多酚酸盐低、高剂量组大鼠肾间质纤维化程
        软件测定条带灰度值，以目标蛋白条带与内参蛋白                             度均较模型组明显改善。与正常组比较，模型组大鼠肾
       （β-actin）条带的灰度值比值表示目标蛋白的表达水平。                       组织阳性染色面积百分比显著升高（P＜0.05）。与模型
        2.6 统计学方法                                          组比较，各给药组大鼠肾组织阳性染色面积百分比均显
            采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。实验数                     著降低（P＜0.05）。与氯沙坦组比较，丹参多酚酸盐低
        据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析；方差                        剂量组大鼠肾组织阳性染色面积百分比差异无统计学
        齐者组间两两比较采用LSD检验，方差不齐者组间两两                          意义（P＞0.05），但丹参多酚酸盐高剂量组大鼠肾组织
        比较采用Dennett’s检验。P＜0.05表示差异具有统计学                    阳性染色面积百分比显著降低（P＜0.05）。与丹参多酚
        意义。                                                酸盐低剂量组比较，丹参多酚酸盐高剂量组大鼠肾组织


        中国药房    2021年第32卷第8期                                              China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 8  ·917 ·
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