Page 89 - 《中国药房》2021年07期
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质量）/模型组肿瘤组织质量。                                     PVDF 膜，用 5％脱脂奶粉封闭；加入 Cyt-C、Bcl-2、Bax
                                                  +
                          +
                     +
        2.4  小鼠 CD4 、CD8 T 淋巴细胞百分数和 CD4 /CD8           +   抗体（稀释度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；以 TBST 漂
        比值的测定                                              洗3次，加入二抗（稀释度为1∶5 000），室温孵育1 h后进
            将小鼠的脾脏置于玻璃平皿中，加入适量 PBS，用                       行化学发光法显色，采用荧光与可见光凝胶成像分析系
        镊子轻轻将脾脏磨碎后，以 200 目筛网过滤。将过滤后                        统拍照。以 GAPDH 为内参，采用 Image J 1.8.0 图像软
        的混悬液以 1 500 r/min 离心 5 min，用适量 PBS 重悬细             件分析，并计算 Cyt-C、Bcl-2、Bax 蛋白与内参的光密度
        胞，制备脾淋巴细胞悬液，并调整细胞密度为 1×10                      6   值比值，来表示目的蛋白的相对表达水平。
        mL 。取脾淋巴细胞悬液 0.1 mL 置于 1.5 mL 离心管                  2.8 统计学方法
           －1
                       +
        中，依次加入 CD4 和 CD8 抗体（稀释度为 1 ∶ 1 000），充                  采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，数据以 x±s 表
                              +
        分混匀后，低温下放置 0.5 h；再加入 PBS 1 mL，以 1 500              示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
        r/min 离心 5 min 后，弃上清液；细胞沉淀继续加入 PBS                 用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
                                           +
        0.5 mL，于流式细胞仪中检测 CD4 、CD8 T 淋巴细胞百                  3 结果
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                            +
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        分数，并计算CD4 /CD8 比值。                                 3.1  柠檬苦素对 MFC 胃癌荷瘤模型小鼠体质量、脾指
        2.5 小鼠血清中IL-2、IL-10及IFN-γ表达水平测定                    数、胸腺指数、抑瘤率的影响
            采用ELISA法进行检测。各组小鼠末次给药后，采                           治疗前，各组小鼠体质量差异无统计学意义（P＞
        用摘眼球法取血，以 12 000 r/min 离心 10 min 分离血               0.05）。治疗后，除环磷酰胺组小鼠体质量较模型组显著
        清。按照试剂盒说明书中的操作步骤，采用酶标仪于                            降低外（P＜0.05），其余各组小鼠体质量的差异均无统
        450 nm 波长下检测血清中 IL-2、IL-10 及 IFN-γ的表达              计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，环磷酰胺组小鼠
        水平。                                                脾指数、胸腺指数均显著降低（P＜0.05），柠檬苦素高、
        2.6  小鼠肿瘤组织中 Cyt-C、Bcl-2、Bax 的 mRNA 相对             中剂量组小鼠的脾指数和柠檬苦素各剂量组的胸腺指
        表达水平的检测                                            数均显著升高（P＜0.05）。环磷酰胺组和柠檬苦素高、
            采用实时定量PCR法进行检测。取“2.3”项下各组                      中 、低 剂 量 小 鼠 的 抑 瘤 率 分 别 为（58.16 ± 7.07）％ 、
        小鼠的肿瘤组织 100 mg，采用 Trizol 法提取总 RNA，根                （37.09±4.26）％、（27.30±3.64）％、（15.13±2.95）％。
        据逆转录试剂盒说明书的操作方法，合成 cDNA。以合                         上述指标测定结果见表2。
        成的 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增，引物序列及产物长                     表2    各组小鼠体质量、脾指数、胸腺指数及抑瘤率的测
        度见表 1。PCR 反应体系为：cDNA 2 μL，SYBR Premix                    定结果（x±±s，n＝10）
        10 μL，上下游引物各0.5 μL，加双蒸水至20 μL。PCR反                 Tab 2 Body weight，spleen index，thymus index and
        应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火                       tumor inhibition rate of mice in each group
        30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。以                     （x±±s，n＝10）
        GAPDH 为内参，采用 2       － Δ Δ Ct  法计算 Cyt-C、Bcl-2、Bax  组别       给药前体质量，g 给药后体质量，g 脾指数，mg/g 胸腺指数，mg/g 抑瘤率，％
                                                            模型组       22.49±1.63  32.05±2.36  5.15±0.74  1.98±0.34
        mRNA的相对表达水平。
                                                            环磷酰胺组     22.25±2.04  25.76±3.25 ＊  4.62±0.68 ＊  1.42±0.28 ＊  58.16±7.07
                    表1   引物序列及产物长度                          柠檬苦素高剂量组  21.60±1.79  32.31±2.80  5.71±0.85 ＊  2.87±0.33 ＊  37.09±4.26
             Tab 1  Primer sequence and product length      柠檬苦素中剂量组  21.75±1.86  31.69±2.38  5.64±0.41 ＊  2.40±0.29 ＊  27.30±3.64
                                                            柠檬苦素低剂量组  22.03±2.41  31.26±3.14  5.48±0.58  2.25±0.21 ＊  15.13±2.95
         基因             引物序列（5′→3′）          产物长度，bp
                                                                           ＊
         Cyt-C      上游：GTTGGACAGCCCCGATTTA     136             注：与模型组比较，P＜0.05
                                                                              ＊
                    下游：TTGAGAAAGGGAAAGCAGTGAT                  Note：vs. model group，P＜0.05
         Bcl-2      上游：ATCTGGGCCACAAGTGAAGT    152         3.2  柠檬苦素对MFC胃癌荷瘤模型小鼠CD4 、CD8 T
                                                                                                   +
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                    下游：GCTGATTCGACGTTTTGCCT                淋巴细胞百分数和CD4 /CD8 比值的影响
                                                                                +
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         Bax        上游：TCATGGGCTGGACATTGGAC    114                                             +     +
                    下游：GAGACAGGGACATCAGTCGC                    与模型组比较，环磷酰胺组小鼠 CD4 、CD8 T 淋巴
                                                                            +
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         GAPDH      上游：ATGGTTTACATGTTCCAATATG  128         细胞百分数和CD4 /CD8 比值均显著降低（P＜0.05），柠
                    下游：ATTTTGGAGGGATCTCGCTC                檬苦素各剂量组小鼠 CD4 、CD8 T 淋巴细胞百分数和
                                                                                        +
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        2.7  小鼠肿瘤组织中 Cyt-C、Bcl-2、Bax 蛋白的相对表                CD4 /CD8 比值均显著升高（P＜0.05），详见图1、表3。
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        达水平的检测                                             3.3  柠檬苦素对 MFC 胃癌荷瘤模型小鼠血清中 IL-2、
            采用Western blot法进行检测。取“2.3”项下各组小                IL-10、IFN-γ表达的影响
        鼠的肿瘤组织 100 mg，加入 RIPA 裂解液适量，低温匀                        与模型组比较，环磷酰胺组小鼠血清中 IL-2、IL-10
        浆；以 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，采用 BCA 法           表达水平均显著降低（P＜0.05），IFN-γ表达水平显著升
        进行总蛋白定量后，于沸水浴中放置 5 min 使蛋白变                        高（P＜0.05）；柠檬苦素高、中、低剂量组小鼠血清中
        性。取等量总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺                            IL-2、IFN-γ表达水平均显著升高（P＜0.05），IL-10 表达
       （SDS-PAGE）电泳分离目的蛋白，电泳完成后转移至                         水平均显著降低（P＜0.05），详见表4。
        中国药房    2021年第32卷第7期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 7  ·847 ·
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