Page 32 - 《中国药房》2020年23期
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蛾 Clanis bilineata Walker 幼虫体上的虫草真菌 ，具有             1.3 菌种
                                                  [6]
        良好的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，其                                野生九州虫草采自山东蒙山天麻林场，由中科院北
        抗氧化性能与冬虫夏草基本相当               [7-8] ，且其不同提取物对        京微生物研究所郭英兰研究员鉴定其无性型菌株为九
        非小细胞肺癌、人白血病细胞株 U937、HL-60 以及人肝                      州轮枝菌；人工九州虫草系由无性型菌株回接人工固体
        癌细胞株 Bel-7402 等均有显著的抑瘤作用              [9-11] ，呈现出   培养基栽培后获得，九州虫草菌丝体系无性型菌株液体
        良好的抗肿瘤药用前景。双向固体发酵是将传统中药                             培养获得，由山东大学微生物技术国家重点实验室提
        与现代生物技术的优势相结合，使用中药材作为药性基                            供。本研究中九州虫草菌株与文献[15]中涉及的为同一
        质取代或添加至真菌培养基，药性基质与真菌相互作                             菌株，且培育方法一致。
        用，基质提供真菌发酵过程中所需的营养成分，真菌在                            2 方法与结果
        中药材所含活性成分基础上通过发酵产生新的成分，可                            2.1 混合对照品溶液的制备
        提高中药药效、产生新的性味和功能、降低毒副作                                  分别称取毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒
        用 [12-13] 。例如，板蓝根经槐耳真菌双向固体发酵后的发                     柄花素、黄芪皂苷Ⅳ、异黄芪皂苷Ⅱ、环黄芪醇、异黄芪
                                                  [14]
        酵物被证实具有抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用 。                             皂苷Ⅰ对照品各适量，置于同一 10 mL 量瓶中，加甲醇
            本课题组前期研究已证实，将具有抗肿瘤活性的九                          制成各成分质量浓度分别为 0.320、0.120、0.100、0.128、
        州虫草真菌与具有类似或协同作用的抗癌中药黄芪共                             1.000、0.400、0.800、0.800 mg/mL 的混合对照品溶液，于
        同进行发酵后，发酵黄芪对非小细胞肺癌细胞 A549 生                         4 ℃冷藏，备用。
        长和增殖的抑制作用显著增强。为探讨黄芪经九州虫                             2.2 九州虫草-黄芪双向固体发酵物的制备
                                                                          [13]
        草双向固体发酵前后的主要化学成分的变化，本研究选                                按文献方法 进行九州虫草菌种固体斜面培养和
        择黄芪中 4 种主要黄酮类成分（毛蕊异黄酮苷、芒柄花                          九州虫草液体菌种培养。在此基础上进行黄芪双向固
                                                            体发酵：称取黄芪药材 4 g、大米 16 g，置于 500 mL 罐头
        苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素）及4种主要皂苷类成分（黄芪
                                                            瓶中，加入35 mL营养液（以每克大米的质量为标准，葡
        皂苷Ⅳ、异黄芪皂苷Ⅱ、环黄芪醇、异黄芪皂苷Ⅰ）为考
                                                            萄糖含量为 0.5％，蛋白胨含量为 1％，磷酸二氢钾含量
        察指标，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-蒸发光
                                                            为 1％，硫酸镁含量为 0.075％，维生素 B1含量为 0.1％，
        检测器（HPLC-DAD-ELSD）联用技术检测黄芪经九州
                                                            玉米面含量为 1％，酵母膏含量为 0.7％），覆以封口膜；
        虫草双向固体发酵前后8种成分的含量，用于研究九州
                                                            在121 ℃下高压灭菌20 min后，冷却，每瓶接种5 mL九
        虫草双向固体发酵对黄芪化学成分的影响，为阐明黄
                                                            州虫草液体菌种，快速均匀喷撒在固体培养基表面，以
        芪-九州虫草双向固体发酵的作用机制奠定基础。
                                                            上操作均在无菌条件下进行；在23 ℃避光培养7 d，然后
        1 材料
                                                            转为光照培养13 d，湿度均为60％，即得九州虫草-黄芪
        1.1  仪器
                                                            双向固体发酵物（以下简称“发酵黄芪”）。同时，以不加
            R-300EL 型旋转蒸发仪[瑞士 Buchi 实验室设备贸
                                                            黄芪的发酵物作为空白样品，同法分别平行发酵 3 份。
        易（上海）有限公司]；1260 InfinityⅡ型 HPLC 仪（美国
                                                            将发酵黄芪、空白样品在阴凉处风干，粉碎后过40目筛，
        Agilent 公司）；116B 型摇摆式高速中药粉碎机（瑞安市
                                                            置于－20 ℃冰箱中保存，备用。另外，以黄芪药材作为
        永历制药机械有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗
                                                            未发酵样品对照，粉碎后过40目筛，置于干燥器中保存，
        器（昆山市超声仪器有限公司）；AE240型十万分之一电
                                                            备用。
        子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。                            2.3  供试品溶液的制备
        1.2  药品与试剂                                              称取黄芪药材4 g以及“2.2”项下发酵黄芪和空白样
            黄芪药材购自山东省济南市建联大药房（批号：                           品各10 g（均相当于黄芪药材4 g），精密称定，分别置于
        20181001），经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为                        250 mL 圆底烧瓶中，加 20 倍量甲醇（mL/g）回流提取 2
        蒙古黄芪A. membranaceus（Fisch.）Bge. var的干燥根；毛           次；每次提取 2.0 h，分别合并提取液，减压浓缩，然后转
        蕊异黄酮苷对照品（批号：M-020-170926）、芒柄花苷对                     移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得黄芪供试品溶液、
        照品（批号：M-013-160906）、毛蕊异黄酮对照品（批号：                    发酵黄芪供试品溶液和空白样品供试品溶液。
        M-021-170517）、芒 柄 花 素 对 照 品（批 号 ：C-018-             2.4 色谱条件
        160304）、黄芪皂苷Ⅳ对照品（批号：H-045-160721）、异                     色谱柱：Agilent 5 TC-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；
        黄芪皂苷Ⅱ对照品（批号：Y-139-171012）、环黄芪醇对照                    柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-0.1％甲酸水溶液（B），梯
        品（批号：H-051-170426）、异黄芪皂苷Ⅰ对照品（批号：                    度洗脱（0～10 min，18％A；10～32 min，18％A→35％A；
        Y-137-171011）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯                     32～40 min，35％A；40～57 min，35％A→53％A；57～
        度均大于 98％；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯或                          67 min，53％A→68％A）；流速：1.0 mL/min；进样量：15
        实验室常用规格，水为实验室自制超纯水。                                 μL；后运行：10 min。检测方式：HPLC-DAD-ELSD串联


        ·2842 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 23                                 中国药房    2020年第31卷第23期
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