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沙市天勤生物技术有限公司[动物生产许可证号：SCXK                         白分析仪检测总 RNA 纯度及浓度（测得 A260 nm/A280 nm在
       （湘）2019-0011]，体质量为（25.20±0.16）g，共 9 只，6 周           1.8～2.1 之间，表明 RNA 的纯度较高）。将提取的总
        龄。购入后，所有小鼠均饲养于右江民族医学院SPF级                          RNA按相应试剂盒说明书步骤进行去DNA和逆转录合
        动物实验中心，直到长至 8 月龄后开始用于实验。SPF                        成 cDNA 后，采用两步法进行 PCR 扩增。反应体系（共
        级实验室的环境室温为 20～25 ℃、相对湿度为 55％～                      20 μL）：上、下游引物各 1 µL、cDNA 模板 2 µL、Fast-
        75％。本研究通过右江民族医学院伦理委员会的审批，                          Start Universal SYBR Green Master（ROX）10 µL、无酶
        实验过程中对动物的处置符合科学技术部颁发的《关于                           水6 µL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，
        善待实验动物的指导性意见》要求。                                   60 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用
        2 方法                                               2 －ΔΔCt 法计算各目的基因 mRNA 的相对表达量（式中 Ct

        2.1 分组与给药                                          是指每个反应管内荧光信号强度达到设定阈值时经历
            取8月龄3×Tg-AD雄性小鼠45只，按随机数字表分                     的循环次数）。引物序列及产物长度见表1。
        为模型组、阳性对照组（石杉碱甲，0.15 mg/kg）和 TSG                                表1 引物序列及产物长度
        低、中、高剂量组（0.033、0.1、0.3 g/kg），每组9只。另外，                   Tab 1 Primer sequence and product length
        取 8月龄 C57BL/6J雄性小鼠9只，作为正常对照组。正                     基因                 序列                   产物长度，bp
        常对照组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水，各给药组小                           JNK       上游：5′-GTGGAATCAAGCACCTTCACT-3′  114
                                                                     下游：5′-TCCTCGCCAGTCCAAAATCAA-3′
        鼠灌胃相应药物，灌胃容积为10 mL/kg，每天给药1次，
                                                           PP2B      上游：5′-GAGCCCAAGGCGATTGATCC-3′   126
        连续给药 60 d。给药组小鼠的给药剂量参考本课题组                                   下游：5′-ATCCACACGAGGTTTCCCATC-3′
                        [4]
        前期已发表的文献 设置。                                       GAPDH     上游：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′   100
                                                                     下游：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′
        2.2  小鼠空间记忆能力检测
                                                           2.5  小鼠脑组织中JNK、PP2B蛋白表达情况检测
            给药结束后第 2 天，各组小鼠进行 Morris 水迷宫定
                                                               采用 Western blotting 法进行检测。水迷宫实验结
        位航行实验，总计5天，每天训练4次，每次间隔30 s。首
                                                           束后，每组取剩余 3 只小鼠，按“2.4”项下方法取材并保
        先将平台放于水池第三象限的中间位置，每天4次训练
                                                           存。取脑组织适量，用液氮研磨，按照每200 mg脑组织
        的入水顺序依次为面向第一、第三、第二、第四象限池壁
                                                           加蛋白裂解液（RIPA高效快速裂解液、蛋白酶抑制剂按
        的中点。实验开始前先将小鼠置于站台上适应30 s，然
        后面朝池壁按照第一、第三、第二、第四象限的顺序依次                          体积比 100 ∶ 1 混合）2 mL 的比例进行匀浆，于冰上充分
                                                           裂解30 min后，在4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，收集
        放入水池中。实验设置为小鼠登上平台 5 s 后终止记
        录，记录小鼠在 60 s 内找到平台的时间（即逃避潜伏                        上清液，采用BCA 法测定蛋白浓度后，用5×蛋白上样缓
                                                           冲液稀释，最后于 95～100 ℃变性 6 min。每孔取 80 μg
        期）。如果小鼠在 60 s 后未登上平台，则时间记为 60 s，
        并人为引导小鼠至平台上停留30 s。                                 蛋白行十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE 凝胶电泳，然后在
            定位航行实验结束后的第 2 天进行空间探索实验，                       180 mA、室温条件下转移 60 min 至 NC 膜上；将膜置于
        共计1天。先撤掉水池中平台，将小鼠从原平台象限的                           QuickBlockTMWestern 封闭液中，摇床上振摇 10 min 封
        反向象限面向池壁中点放入水中，通过 DigBehv 2.3 动                    闭；用TBST清洗10 min×3次，分别加入JNK一抗（稀释
        物行为分析系统记录小鼠在60 s内的游泳轨迹，并计算                         比例为 1 ∶ 6 000）、PP2B、β-actin和GAPDH一抗（稀释比
        其在原平台象限的停留时间和穿越原平台次数。                              例均为 1 ∶ 5 000），于 4 ℃孵育过夜；用 TBST 清洗 10
        2.3 小鼠脑皮层、海马部位神经元尼氏小体检测                            min×3 次，加入相应的二抗（稀释比例均为 1 ∶ 5 000），于
            水迷宫实验结束后，每组随机选3只小鼠，颈椎脱臼                        4 ℃下避光振摇 1 h；用 TBST 清洗 10 min×3 次，以超灵
        处死，冰上操作取出完整大脑，经脱水等常规处理后包                           敏感化学发光液进行发光显色，采用 Imagej v1.8.0 软件
        埋成蜡块，切片（厚度为4 μm）。选取合适脑组织切片进                        测定条带灰度值。其中JNK以GAPDH为内参，PP2B以
        行尼氏染色、中性树胶封片，然后在显微镜下观察脑皮                           β-actin为内参，以目的蛋白条带与相应内参蛋白条带灰
        层、海马部位的尼氏小体染色情况。                                   度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。
        2.4 小鼠脑组织中JNK、PP2B mRNA表达情况检测                      2.6 统计学方法
            采用实时荧光定量-PCR（qRT-PCR）法进行检测。                        采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析。计
        水迷宫实验结束后，每组随机选 3 只小鼠，颈椎脱臼处                         量资料以x±s表示。多组间比较使用单因素方差分析；
        死，冰上操作取出完整大脑，保存于液氮中。取脑组织                           方差齐性时组间两两比较采用LSD检验，方差不齐性时
        适量，用液氮研磨后，参照 AxyPrep 总 RNA 小量制备试                   组间两两比较采用Tamhane’s T2检验。P＜0.05表示差
        剂盒中说明书方法提取总RNA，然后立即用微量核酸蛋                          异具有统计学意义。


        中国药房    2020年第31卷第19期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19  ·2341 ·
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