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性对照组细胞加入100 μL常规培养液，阳性对照组细胞                         成像仪下拍照成像，用Quantity One 4.6.2软件分析条带
        加入终质量浓度为4 mg/L的含吉西他滨培养基 ，龙胆                         光密度值。以目的基因条带光密度值与内参（β-actin）条
                                                 [13]
        苦苷低、中、高浓度组细胞分别加入终质量浓度为 15、                          带光密度值的比值表示目的基因 mRNA 的相对表达水
        30、60 mg/L 的含龙胆苦苷培养基。于给药培养第 1、3、                    平。待测基因引物序列及产物扩增长度见表1。
        5、7 天，分别收集细胞并制成悬液，与 0.4％台盼蓝溶液                               表1 基因引物序列及产物扩增长度
        以9∶1（V/V）的比例混合均匀，在3 min内，用计数板计数                     Tab 1 Primer sequence and product amplification
        活细胞数（显微镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细                                  length
        胞拒染）。                                               基因        上游引物               下游引物          产物扩增
        2.4 龙胆苦苷对PANC-1细胞克隆形成的影响考察                          名称                                         长度，bp
                                                            IL-6  5′-TACATCCTCGACGGCATCTC-3′ 5′-AGGACACTGTCTTTGAGCCT-3′  359
            采用克隆形成试验进行测定。收集对数生长期
                                                            JAK2 5′-AGGGGTTGTTCGTTGTTGTCA-3′ 5′-TCCTTCCCTTCAACCCAAAATC-3′  252
        PANC-1 细胞，以 0.25％胰酶消化后制成细胞悬液，按                      STAT3 5′-CTGCCCCATACCTGAAGACC-3′ 5′-TCCTCACATGGGGGAGGTAG-3′  212
        500 个/皿接种于 60 mm 培养皿中，按“2.3”项下方法分                   β-actin 5′-GACTTCGAGCAGGAGATGGC-3′ 5′-CAGGAAGCAAGGCTGGAAGA-3′  128
        组、给药，培养72 h。吸弃培养皿中培养液，更换为无药                         2.7  龙胆苦苷对细胞中IL-6、JAK2和STAT3蛋白表达
        新鲜培养基后继续培养，直至每个培养皿中均出现50个                           的影响考察
        以上克隆即终止试验。将培养皿中培养基小心倒弃，以                                采用 Western blotting 法进行测定。按“2.6”项下方
        磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗细胞3 min×2～3次，甲醇固定                      法接种、分组、给药，培养72 h。收集细胞于1.5 mL离心
        20 min，再用 Giemsa 溶液染色 15 min，然后置于倒置显                管中，加入 1 mL RIPA 蛋白裂解液于冰上充分裂解 30
        微镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。按照公式计算克                          min，提取细胞总蛋白，按 BCA 试剂盒方法测定各样本
        隆形成率：克隆形成率（％）＝克隆数/接种细胞数×                            蛋白浓度并调整一致。然后将蛋白在 95 ℃水中加热 5
        100％。                                               min 变性，80 V 电压下行 SDS-PAGE 电泳，300 mA 恒流
        2.5  龙胆苦苷对PANC-1细胞凋亡的影响考察                           下将蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；室温下用
            采用 Hoechst 33258 荧光染色法进行测定。收集对                  5.0％脱脂奶粉封闭 1 h，然后分别加入 IL-6（1 ∶ 1 000）、
        数生长期 PANC-1 细胞，以 0.25％胰酶消化后制成密度                     JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）一抗，
        为2×10 个/mL的细胞悬液，以2 mL/孔接种于6孔板中，                     4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲液漂洗3 min×3次，加入二抗
               5
        按“2.3”项下方法分组、给药，培养72 h。吸弃培养液，用                     （1 ∶ 2 000），室温孵育1 h；然后加入化学发光（ECL）显色
        无菌 PBS 溶液漂洗细胞 3 min×2～3 次，用 4％多聚甲醛                  液，于凝胶成像仪下显影拍照，用Quantity One 4.6.2软件
        溶液固定 30 min，然后加入 Hoechst 33258 染色液（5                分析条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参（β-
        μg/mL），室温下避光染色 15 min，再在超净工作台中风                     actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。
        干后，于荧光倒置显微镜下观察细胞凋亡情况（正常细                            2.8  统计学方法
        胞核染为均匀蓝色，凋亡细胞核固缩、呈强蓝色致密浓                                 应用 SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料以
        染）。按照公式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率（％）＝凋                           x±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，
        亡细胞数/（凋亡细胞数+正常细胞数）×100％。                            组间两两比较采用 t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计
        2.6  龙胆苦苷对 PANC-1 细胞中 IL-6、JAK2 和 STAT3             学意义。
        mRNA表达的影响考察                                         3 结果
            采用逆转录（RT）-PCR法进行测定。收集对数生长                       3.1  龙胆苦苷对PANC-1细胞增殖的影响
        期PANC-1细胞，以0.25％胰酶消化后制成细胞悬液，按                           与阴性对照比较，4、8、16、32、64、128 mg/L 龙胆苦
        2×10 个/孔接种于6孔板中，然后按“2.3”项下方法分组、                     苷作用72 h后细胞的OD值均显著降低（P＜0.05或P＜
             5
        给药，培养 72 h。吸弃培养液，收集细胞，用 Beyozol 试                   0.01），表明其可不同程度地抑制细胞的增殖，并且具有
        剂提取细胞总RNA[取2 μL总RNA样品，于260、280 nm                   浓度依赖性趋势。龙胆苦苷对 PANC-1 细胞的 IC50 为
        波长下分别检测RNA样品的吸光度（A），A260/A280值介于                    9.54 mg/L。结果见表2。
        1.8～2.0 之间，表明样品纯度较高]。将总 RNA 逆转录                     3.2 龙胆苦苷对PANC-1细胞生长的影响
        为 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增试验。反                        在培养 1 d 后，各组的活细胞计数差异均无统计学
        应体系（25 μL）：cDNA 模板 5 μL，上、下游引物各 1 μL，               意义（P＞0.05）。与阴性对照组比较，在培养 3、5、7 d
        2× Master Mix 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL。扩增条件：94 ℃        后，吉西他滨组和龙胆苦苷中、高浓度组活细胞计数均
        预变性 3 min；94 ℃变性 45 s，57 ℃退火 75 s，72 ℃延伸            明显减少（P＜0.05或P＜0.01）。与吉西他滨组比较，龙
        90 s，共30个循环；最后以72 ℃充分延伸10 min，结束反                   胆苦苷中浓度组在培养3 d后的活细胞计数以及龙胆苦
        应。取 5 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶（2％）电泳，凝胶                     苷高浓度组在培养3、5、7 d后的活细胞计数差异均无统


        ·1838  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15                                中国药房    2020年第31卷第15期
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