Page 51 - 202015
P. 51

gentiopicroside could inhibit the proliferation and induce apoptosis of PANC-1 cells，and 60 mg/L gentiopicroside is similar to
        gemcitabine in the effects. Its mechanism may be related to inhibiting the activation of IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway.
        KEYWORDS    Gentiopicroside；Human pancreatic cancer cells PANC-1；Apoptosis；IL-6；JAK2；STAT3；Mechanism


            胰腺癌（Pancreatic cancer）是临床上常见的消化系               Hoechst 33258 染 色 液 、NP-40 裂 解 液 、二 喹 啉 甲 酸
        统肿瘤，具有起病隐匿、早期诊断困难、预后差及病死率                          （BCA）蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯
        高等特点，恶性程度极高          [1-2] 。胰腺癌发病机制复杂，目            酰胺（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（武汉博士德生物工
        前认为炎症反应与其发生、发展、转移及预后密切相关，                          程 有 限 公 司 ，批 号 ：AR1169、AR0107、AR0197、
        加速了疾病的进程        [3-4] 。白细胞介素6（IL-6）/Janus激酶2       AR0138）；兔抗IL-6、JAK2、STAT3多克隆抗体以及辣根
       （JAK2）/信号转导与转录激活因子 3（STAT3）信号通路                     过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗（美
        是目前发现的重要的炎症信号通路之一，参与了机体的                           国 Affinity Biosciences 公 司 ，批 号 ：DF6087、AF6022、
        免疫调节、血管生成及细胞的增殖分化等多种生理病理                           AF6294、A0001）；DMEM 高糖培养基（北京索莱宝科技
        过程，与肿瘤的发生、发展、转移及侵袭等生物学行为                           有限公司）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。PCR试
        密切相关，且其表达异常对肿瘤的预后有重要指导意                            验所需引物由苏州金唯智生物科技有限公司设计与
        义 [5-6] 。因此，抑制和调控 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路有            合成。
        助于肿瘤的防治及改善预后，同时其也是筛选抗肿瘤药                           1.3 细胞
        物的重要靶点之一        [7-8] 。龙胆苦苷（Gentiopicroside）是从         人胰腺癌细胞株PANC-1购自中国科学院上海生命
        秦艽、龙胆草等龙胆科龙胆属植物中提取的一种环烯醚                           科学研究院细胞资源中心。
        萜苷类单体化合物，具有抗炎、抗氧化应激、抗风湿及抗                          2 方法
                        [9]
        肝损伤等药理作用 ；亦有报道指出，龙胆苦苷具有抑制                          2.1  细胞培养与处理
        卵巢癌、肝癌及肺癌等肿瘤细胞的增殖、迁移等作用                    [10-12] ，   将 PANC-1 细胞置于含 12％胎牛血清的 DMEM 培
        但龙胆苦苷对胰腺癌的影响尚未见文献报道。基于此，                           养基中，于 5％CO2、饱和湿度、37 ℃条件 CO2培养箱中
        本文通过研究龙胆苦苷对胰腺癌细胞 PANC-1 增殖、凋                       培养（培养条件下同），每 2～3 天更换 1 次培养液，当细
        亡的影响，同时检测 IL-6/JAK2/STAT3 信号通路相关因                  胞长满至培养瓶 80％～95％时进行传代。待细胞生长
        子表达水平的变化，初步探讨其抗胰腺癌的作用及机                            至对数生长期（3～4代细胞）时进行相关试验，每项试验
        制，旨在为深入研究龙胆苦苷抗肿瘤药理作用提供                             均重复3次。
        依据。                                                2.2  龙胆苦苷对PANC-1细胞增殖的影响考察
        1 材料                                                   采用 MTT 法进行测定。收集对数生长期 PANC-1
                                                                                                 3
        1.1  仪器                                            细胞，以0.25％胰酶消化后制成密度为5×10 个/mL的细
            CKX53型荧光倒置显微镜[奥林巴斯（中国）有限公                      胞悬液，按200 μL/孔的细胞密度接种于96孔板中，培养
        司]；ST-360 型酶标仪（上海科华生物工程股份有限公                       24 h 待细胞贴壁后，分别加入终质量浓度为 0（阴性对
        司）；Forma 系列 3 水套式 CO2培养箱[赛默飞世尔科技                   照）、2、4、8、16、32、64、128 mg/L 的含龙胆苦苷培养基，
       （中国）有限公司]；SJ-CJ-2FD型超净工作台[苏洁医疗器                     每个质量浓度设 3 个复孔。培养 72 h 后，加入 0.5％
        械（苏 州）有 限 公 司]；GelDoc XR + 型 凝 胶 成 像 仪 、           MTT溶液20 μL，继续培养4 h后终止培养。小心吸弃培
        Mini-PROTEAN Tetra Cell 型小型垂直电泳槽、小型                养孔内上清液，然后加入 DMSO 150 μL，于水平摇床上
                      ®
        Trans-Blot 转印槽、S1000 TM  96 Deep Well 型聚合酶链式       振荡15 min使结晶物充分溶解，最后用酶标仪于490 nm
        反应（PCR）仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]；                        波长处测定各孔吸光度（OD）值，OD 值越高，则细胞活
        AE224型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）。                          性越高。按照公式计算龙胆苦苷对PANC-1细胞的增殖
        1.2 药品与试剂                                          抑制率：增殖抑制率（％）=（1－试验孔 OD 值/阴性对照
            龙胆苦苷标准品[南京泽朗生物科技有限公司，批                         孔OD值）×100％。应用Graphpad Prism 5.0软件计算半
        号：20180526，纯度：≥98％；临用时用含 0.1％二甲基亚                  数抑制浓度（IC50 ）。
        砜（DMSO）的培养基配制为相应药液]；胎牛血清（美国                        2.3 龙胆苦苷对PANC-1细胞生长的影响考察
        HyClone公司，批号：20180415）；Beyozol总RNA抽提试                  采用台盼蓝拒染法进行测定。收集对数生长期
        剂、BeyoRT  TM  Ⅲ cDNA 第一链合成试剂盒、Easy-Load       TM   PANC-1 细胞，以 0.25％胰酶消化后制成密度为 1×10                4
        PCR Master Mix（Blue，2×）、琼脂糖（碧云天生物技术有               个/mL 的细胞悬液，按 100 μL/孔的细胞密度接种于 96
        限公司，批号：R0011、D7178S、D7251、ST004L）；Giemsa           孔板中。将细胞分为阴性对照组、阳性对照组和龙胆苦
        染色液（南京建成生物工程研究所，批号：180215）；                        苷低、中、高浓度组，每组设3个复孔。待细胞贴壁后，阴


        中国药房    2020年第31卷第15期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15  ·1837  ·
   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56