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胞增殖率（％）＝（A 试验－A 空白 ）/（A 对照－A 空白 ）×100％。式 表1 引物序列及扩增产物长度
中，A 试验为试验孔吸光度值，A 对照为对照孔吸光度值（不 Tab 1 Primer sequence and the length of amplified
含药物），A 空白为空白孔吸光度值（不含细胞和药物）。试 product
验重复10次。 基因 引物序列 扩增产物长度，bp
2.3 苦参碱对细胞培养液中Hyp含量的影响考察 TGF-β1 上游：5′-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCT-3′ 24
下游：5′-CGCTGAATCGAAAGCCCTGTA-3′ 21
采用酶消化法检测。取细胞悬液，按1×10 个/孔的
4
TβR-Ⅰ 上游：5′-GCTGACATCTATGCAATGGGCTTA-3′ 24
密度接种于 96 孔板中。将细胞分为空白对照组、模型 下游：5′-AGGCAACTGGTAGTCTTCGTGGA-3′ 23
组、阳性对照组（2.5 μmol/L秋水仙碱）和苦参碱中、高浓 TβR-Ⅱ 上游：5′-GCGATCTAACCTGTTGCCTGTG-3′ 22
度组（60、120 μmol/L），每组设置3个复孔。按“2.2”项下 下游：5′-GGGCCATGTATCTCGCTGTTC-3′ 21
α-SMA 上游：5′-CCGAGATCTCACCGACTACC-3′ 20
方法进行细胞活化、给药和培养后，吸取上清液，以3 000 下游：5′-TCCAGAGCGACATAGCACAG-3′ 20
r/min离心10 min，取上清，按照Hyp试剂盒说明书操作， Smad3 上游：5′-CTGGCTACCTGAGTGAAGATG-3′ 21
检测细胞培养液中Hyp的含量。试验重复10次。 下游：5′-TGTGAAGCGTGGAATGTCTC-3′ 20
Smad4 上游：5′-TGGAAGTAGGACTGCACCATACAC-3′ 24
2.4 苦参碱对细胞培养液中Col-ⅠⅠ、Col-ⅢⅢ含量的影响
下游：5′-AGCAATGGAACACCAATATTCAGG-3′ 24
考察 Smad7 上游：5′-GCATCTTCTGTCCCTGCTTC-3′ 20
采用 ELISA 法检测。按“2.3”项下方法分组，每组 下游：5′-CCGGTCTTCCTTTCCTTTTC-3′ 20
GAPDH 上游：5′-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′ 20
设置 3 个复孔，按“2.2”项下方法进行细胞活化、给药和
下游：5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′ 20
培养后，吸取上清液，以 3 000 r/min 离心 10 min，取上
一抗，于37 ℃条件下孵育4 h；TBST 缓冲液洗膜3次，按
清，按照 Col-Ⅰ和 COL-Ⅲ ELISA 检测试剂盒说明书操
1 ∶ 1 000 的稀释度加入 IgG 二抗，于 37 ℃条件下继续孵
作，检测细胞培养液中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量。试验重
育 2 h。采用 ECL 检测试剂显影，以一体式微型化学发
复6次。
光成像仪扫描、分析各蛋白质条带的灰度值，以目标蛋
2.5 苦参碱对细胞中α-SMA、TGF-β 1、TβR-ⅠⅠ、TβR-
Ⅱ、Smad3、Smad4和Smad7 mRNA表达的影响考察 白条带与内参GAPGH条带的灰度值的比值表示目标蛋
Ⅱ
白的表达水平。试验重复6次。
采用 RT-PCR 法检测。按“2.3”项下方法分组，每组
2.7 统计学方法
设置 3 个复孔，按“2.2”项下方法进行细胞活化、给药和
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料
培养后，吸弃培养基，收集细胞，按 RNA 提取试剂盒说
以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
明书操作，提取细胞中总 RNA。验证提取 RNA 的纯度
两比较采用 SNK 检验。P＜0.05 表示差异有统计学
和浓度后，取 1 μg 总 RNA 进行反转录合成 cDNA，并以
意义。
cDNA 为模板进行 PCR 扩增。反应体系：cDNA 模板 2
μL，dNTP 溶液 1.6 μL，BeyoTaq Buffer 2 μL，BeyoTaq 3 结果
DNA Polymerase 0.1 μL，上、下游引物各 0.8 μL，双蒸水 3.1 细胞存活率测定结果
12.7 μL，总体积为 20 μL。反应条件：95 ℃预变性 4 与空白对照组比较，模型组细胞的存活率显著升高
min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 （P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和苦参碱中、高
个循环。以 GAPDH 为内参，采用 2 －ΔΔC t 法计算细胞中 浓度组细胞存活率显著降低（P＜0.05），且苦参碱的作
α-SMA、TGF-β 1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4 mRNA 用具有量效关系（P＜0.05）。这提示中、高浓度苦参碱
的表达水平（ct表示每个反应管内荧光信号强度达到设 可以有效抑制活化细胞的异常增殖，故后续试验选择这
定阈值时所经历的循环数）。试验重复6次。引物序列 2个浓度进行研究。各组细胞存活率测定结果见图1。
及扩增产物片段长度见表1。 3.2 细胞培养液中 Hyp、Col-ⅠⅠ和 Col-ⅢⅢ的含量测定
2.6 苦参碱对细胞中α-SMA、TGF-β 1、TβR-ⅠⅠ、TβR- 结果
Ⅱ Ⅱ、Smad3和Smad4蛋白表达的影响考察 与空白对照组比较，模型组细胞培养液中Hyp、Col-
采用 Western blotting 法检测。按“2.3”项下方法分 Ⅰ和 Col-Ⅲ的含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，
组，每组设置3个复孔，按“2.2”项下方法进行细胞活化、 阳性对照组和苦参碱中、高浓度组细胞培养液中 Hyp、
给药和培养后，吸弃培养基，参照文献[11]的方法，收集 Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量均显著降低（P＜0.05）；与苦参碱
细胞，按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书 中浓度组比较，苦参碱高浓度组细胞培养液中Hyp、Col-
操作步骤，分别提取细胞浆蛋白和细胞核蛋白，将两者 Ⅰ和 Col-Ⅲ的含量均显著降低（P＜0.05）。各组细胞中
合并，以二喹啉甲酸（BCA）法测定总蛋白含量。将合并 培养液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量测定结果见表2。
的总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、 3.3 细胞中TGF-β 1、TβR-ⅠⅠ、TβR-ⅡⅡ、α-SMA、Smad3、
湿转法转膜、5％脱脂奶粉室温封闭2 h后，按1 ∶ 1 000的 Smad4和Smad7的mRNA表达水平测定结果
稀释度加入 TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad4、Smad7 和 GAPGH 与空白对照组比较，模型组细胞中α-SMA、TGF-β 1、
中国药房 2020年第31卷第11期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11 ·1355 ·
