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技有限公司）；ECO 48 型聚合酶链式反应（PCR）仪（英 2.3 沙苑子多糖对软骨细胞增殖抑制率的影响考察
4
国 PCRmax 公司）；MP4 型垂直电泳仪（美国 Bio-Rad 公 采用 MTT 法检测。将软骨细胞以 5×10 个/孔接种
司）；XSP-12CAC 型光学显微镜（上海缔伦光学仪器有 于96孔板中，按“2.2”项下方法进行分组和给药，每组设
限公司）。 置 5 个复孔，并于药物干预 24、48、72、96 h 后，每孔加入
1.2 药品与试剂 20 μL MTT 溶液，继续培养 4 h。弃细胞培养液，每孔加
沙苑子多糖（陕西斯诺特生物技术有限公司，批 入 150 μL 二甲基亚砜，置于摇床避光孵育 10 min 后，于
号：171211C，纯度：≥96％）；四唑盐（MTT）比色法检 酶标仪上测定各孔的吸光度值，然后计算细胞增殖抑
[15]
测试剂盒（北京群晓科苑生物技术有限公司，批号： 制率 ：细胞增殖抑制率＝（正常对照组吸光度值－试
YS171211A）；反转录试剂盒（日本 Takara 公司，批号： 验组吸光度值）/正常对照组吸光度值×100％。
180223CC）；RT-PCR 试剂盒（南京威特森生物技术有 2.4 沙苑子多糖对软骨细胞周期的影响考察
限公司，批号：180115001）；细胞裂解液（南京碧云天 采用流式细胞术检测。将软骨细胞以1×10 个/孔接
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生物技术研究所，批号：180221A）；胰蛋白酶（批号： 种于 6 孔板中，按“2.2”项下方法进行分组和给药，每组
20150623）、Ⅱ型胶原酶（批号：1225C071）均购自北京索 设置 5 个复孔，于 5％CO2、37 ℃条件下培养 72 h。收集
莱宝生物科技有限公司；Col Ⅱ酶联免疫吸附试验（ELI- 细胞于1.5 mL离心管中，加入70％无水乙醇固定1 h后，
SA）试剂盒（批号：1803110001）、ALP ELISA 试剂盒（批 按细胞周期检测试剂盒说明书进行相关操作，然后使用
号：1802150002）均购自武汉云克隆科技股份有限公司； 流式细胞仪检测细胞周期的变化。
流式细胞周期检测试剂盒（美国 Biovision 公司，批号： 2.5 沙苑子多糖对软骨细胞中Col ⅡⅡ、ALP蛋白表达水
YLN180111002）；Col Ⅱ兔单克隆抗体（批号：1801002）、 平的影响考察
ALP 兔单克隆抗体（批号：1802005）、TGF-β 1 兔单克隆 采用 ELISA 法检测。将软骨细胞以 5×10 个/孔接
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抗 体（批号：1804001）、BMP-2 兔单克隆抗体（批号： 种于96孔板中，按“2.2”项下方法进行分组和给药，每组
1804009）、β-肌动蛋白（β-actin，批号：2015052250）、辣根 设置 5 个复孔，于 5％CO2、37 ℃条件下培养 72 h 后，按
过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二 ELISA试剂盒说明书进行相关操作，检测Col Ⅱ、ALP蛋
抗（批号：1711160）均购自美国Abcam公司；PCR引物合 白表达水平。
成由南京科佰生物科技有限公司完成。 2.6 沙苑子多糖对软骨细胞中 TGF-β 1、BMP-2 mRNA
1.3 动物 表达水平的影响考察
SPF级新西兰大白兔1只，雄性，1月龄，体质量0.75 采用逆转录 PCR（RT-PCR）法检测。将软骨细胞以
kg，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，动物生产许 1×10 个/孔接种于 6 孔板中，按“2.2”项下方法进行分组
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可证号：SCXK（甘）2018-0001。 和给药，每组设置5个复孔，于5％CO2、37 ℃条件下培养
2 方法 72 h。收集细胞至1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol试
2.1 细胞分离 剂，静置30 min，加入1/5体积氯仿，涡旋振荡15 s后，以
参考文献方法 [13-14] 分离软骨细胞。将新西兰大白兔 12 000 r/min离心15 min。取上层清液，加入等体积异丙
适应性喂养1周后，剖取四肢膝关节半月板并剪碎成颗 醇，上下颠倒混匀后冰浴10 min，以12 000 r/min离心10
粒，加入0.25％的胰蛋白酶后置于37 ℃恒温水浴锅中消 min，弃上清，沉淀中加入1 mL 70％无水乙醇，以12 000
化 30 min；以 1 500 r/min 离心 15 min，弃上清，向沉淀中 r/min离心5 min，弃去乙醇，风干沉淀，加入无RNA酶水
加入0.3％Ⅱ型胶原酶后置于37 ℃恒温水浴锅中消化4 溶解沉淀。按反转录试剂盒说明书操作，将 RNA 反转
h；取上层悬液，以 1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，向沉 录为 cDNA，再按 PCR 试剂盒说明书操作进行 PCR 扩
淀中加入含 10％ 胎牛血清的 DMEM 培养基进行重悬， 增。TGF-β 1上游引物为5′-TACCACTACGGATCGTTA-
再以5×10 个/mL接种在细胞培养瓶中，于5％CO2、37 ℃ GA-3′，下游引物为 5′-GACTGAACTAGCTAGCAATC-
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条件下培养，备用。 GA-3′，产物长度为 131 bp；BMP-2 上游引物为 5′-TA-
2.2 沙苑子多糖对软骨细胞形态的影响观察 AGCTGACATGGTACCAGAT-3′，下游引物为5′-TAAC-
将软骨细胞以5×10 个/孔接种于96孔板中，分为正 GTATGACCATAGGAAT-3′，产物长度为 112 bp；β-actin
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常对照组、阳性对照组（硫酸氨基葡萄糖，10 mg/mL，剂 上游引物为 5′-ACAGTAATGCCGTAACGTTC-3′，下游
量根据临床用药剂量及预试验结果确定）和沙苑子多糖 引物为 5′-GATGCAATGGCTCAGATAGCA-3′，产物长
高、中、低剂量组（40、20、10 mg/mL，剂量根据文献[15] 度为 109 bp。扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性
及预试验确定），每组设置3个复孔，加入相应药物（用磷 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共 30 个循环；最后
酸盐缓冲液配制），正常对照组加入等体积 PBS。各组 72 ℃延伸 10 min。然后采用荧光分析软件对各孔 ct值
细胞于 5％CO2、37 ℃条件下培养 0、48、72 h 后，用光学 进行分析，以β-actin 为内参计算 TGF-β 1、BMP-2 mRNA
显微镜观察软骨细胞的生长情况。 的相对表达水平。
中国药房 2020年第31卷第9期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 9 ·1099 ·
