Page 12 - 2020年1月第31卷第2期
P. 12

1.3 细胞                                              13 500 r/min 离心 15 min 后，吸取上清液 700 μL 至 1.5
            人肝癌 Huh7、BEL-7402 细胞均购自美国菌种保藏                   mL 离心管中，冻干，备用。取所有样本剩余上清液各
        中心（ATCC细胞库）。                                        20 μL 混匀，作为本研究质量控制（QC）样品，冻干，备
        2 方法                                                用。取上述冻干样品，分别加入甲氧胺 50 μL，在 37 ℃
        2.1 细胞培养                                            水浴 1 h，以 14 000 r/min 离心 2 min；加入衍生化试剂
            取 Huh7 细胞和 BEL-7402 细胞，分别在 37 ℃、5％              MSTFA 40 μL，在 37 ℃水浴 1 h，以 14 000 r/min 离心 10
        CO2条件下培养 24 h，待细胞生长至对数生长期后用于                        min，再按“2.3.1”“2.3.2”项下色谱和质谱条件进样分
        后续试验。                                               析。计算QC样本GC-MS谱图中各成分峰面积RSD，用
        2.2 DHA 对 Huh7 细胞和 BEL-7402 细胞活性的影响                 来评价样品预处理过程和仪器分析的稳定性（RSD≤
        考察                                                  30％即可）。
            取“2.1”项下对数生长期的 Huh7 细胞和 BEL-7402                2.3.4  数据处理分析        建立包含保留时间和特征离子
        细胞，用 0.25％胰蛋白酶消化，以 800 r/min 离心 5 min，              信息的定量峰表，导入GC-MS仪器配置的Postrun Anal-
        弃去上清液，加入含10％FBS的DMEM培养基（以下简                         ysis 2.7 工作站，对数据进行批量积分处理，获得包含保
        称培养基）1 mL，细胞计数后，按 2 000 个/孔加入 96 孔                  留时间、特征离子和峰面积的原始峰表，并以总峰面积
        板，轻晃至细胞均匀平铺于板底即可。次日，待细胞贴                            计算相对峰面积进行校正。
        壁后将其分为对照组和 DHA 不同剂量组（DHA 终浓度                            采用SPSS 17.0统计学软件对细胞活性试验数据进
        分别为 12.5、25、50、100 μmol/L），对照组加入不含药物                行处理；采用GC-MS仪器工作软件、SIMCA-P 11.0软件
        的培养基，DHA各剂量组加入相应浓度的含药培养基，                           中的主成分分析（PCA）功能对代谢物含量测定数据进
        每组设 4 个复孔。加药后继续在 37 ℃、5％CO2条件下                      行处理。
        培养24、48、72 h。取出细胞，按CCK-8检测试剂盒方法                     3 结果
        操作，每孔加入 CCK-8 试剂 20 μL，采用酶标仪于 450                   3.1  不 同 浓 度 DHA 作 用 不 同 时 间 对 Huh7 细 胞 和
        nm 波长处检测各孔吸光度（OD）值，用来表示细胞活                          BEL-7402细胞生长的影响
        性。试验均重复3次。                                              实验结果显示，随着DHA浓度的增加，或随着药物
        2.3  GC-MS 法测定 Huh7 细胞和 BEL-7402 细胞中氨               作用时间的增加，Huh7 细胞和 BEL-7402 细胞的活性均
        基酸代谢物含量                                             呈下降趋势，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜

        2.3.1  色谱条件      色谱柱：DB-5 MS 毛细管柱（30 m×             0.05），表明DHA具有抑制两种肝癌细胞生长的能力，且
        250 μm，0.25 μm）；载气：氦气；线性速度：40 cm/s；恒流               呈剂量依赖和时间依赖趋势。以对照组细胞活性为基
        模式：1.19 mL/min；程序升温（起始温度 70 ℃，保持 3                  准进行比较，经 25 μmol/L DHA 作用 24 h 时，Huh7 细胞
        min 后，以5 ℃/min的速度升至300 ℃，保持 10 min）；进               的活性降至58％，BEL-7402细胞的活性降至75％；经该
        样温度：280 ℃；进样量：1 μL；分流比：10∶1。                        浓度 DHA 作用 48 h 时，Huh7 细胞的活性降至 41％，
        2.3.2  质谱条件      EI离子源；界面温度：300 ℃；离子源               BEL-7402 细胞的活性降至 47％。由此表明，25 μmol/L
        温度：230 ℃；EI轰击电压：70 eV；周期：0.2 s；检测电压：                DHA作用24 h起对两种细胞就表现出明显的活性抑制
        0.92 kV；扫描范围：质荷比（m/z）：33～600 Da；溶剂切割                作用，故本研究选择以25 μmol/L的DHA作用24 h进行
        时间：5.5 min。采用全扫描模式，扫描的离子为各个衍                        后续试验，详见表1。
        生产物的特征离子。                                           表 1 DHA 对 Huh7 细胞和 BEL-7402 细胞活性的影响
        2.3.3  细胞样品预处理         取“2.1”项下对数生长的Huh7                （x±±s，n＝3）
        细胞和BEL-7402细胞，计数后分别以2×10 个/皿接种于                     Tab 1 Effects of DHA on the viability of Huh7 cells
                                             6
        10 cm的平皿中，在37 ℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培                            and BEL-7402 cells（x±±s，n＝3）
        养24 h。每种细胞均随机分为两组，一组加入培养基10                         组别   剂量，μmol/L     Huh7细胞           BEL-7402细胞
                                                                            24 h     48 h      24 h    48 h
        mL 作为对照组，另一组加入含 25 µmol/L DHA 的培养
                                                            对照组     0     1.00±0.08  1.00±0.05  1.00±0.04  1.00±0.02
        基10 mL作为给药组，继续培养24 h，每组均平行操作3                       DHA组    12.5  0.77±0.07 ＊  0.58±0.03 ＊＊  0.87±0.02  0.63±0.01 ＊
        份。培养结束后取出细胞培养皿，弃去培养基，以预冷                                    25    0.58±0.03 ＊＊  0.41±0.05 ＊＊  0.75±0.04 ＊  0.47±0.02 ＊＊
                                                                    50    0.41±0.06 ＊＊  0.36±0.04 ＊＊  0.62±0.04 ＊  0.37±0.02 ＊＊
        的 PBS 洗涤 3 次，每皿加入预冷的甲醇 1 mL，用细胞刮                           100    0.26±0.05 ＊＊  0.26±0.02 ＊＊  0.37±0.04 ＊＊  0.28±0.01 ＊＊
        铲刮下细胞，转移至5 mL EP管中，涡旋混匀5 min，超声                        注：与同一时间点对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
                                                                                    ＊
                                                                                           ＊＊
        处理20 s，再涡旋混匀1 min后，静置10 min；在4 ℃下以                     Note：vs. control group at same time point， P＜0.05， P＜0.01
                                                                                                  ＊＊
                                                                                           ＊
        ·134  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 2                                   中国药房    2020年第31卷第2期
   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17