Page 33 - 《中国药房》2026年10期
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学标准盲法记录白细胞（white blood cell，WBC）、EOS、                        表1 PCR引物序列及产物长度
          中性粒细胞（neutrophil，NEU）、淋巴细胞（lymphocyte，              基因名称              引物序列（5′→3′）         产物长度/bp
          LYM）、单核细胞（monocyte，MONO）及嗜碱性粒细胞                     GAPDH         正向：TGTTCTAGAGACAGCCGCAT    83
                                                                            反向：AAATCCGTTCACACCGACCT
         （basophil，BASO）数量。每个样品随机选取 20 个视野，                   TLR4          正向：TCCAGAGCCGTTGGTGTATC   133
          记录每个视野中各类细胞的数量，计算其平均值作为相                                          反向：TACAATTCGACCTGCTGCCT
          应细胞计数结果。                                            MyD88         正向：CTCGCAGTTTGTTGGATGCC   119
                                                                            反向：CTCGATGCGGTCCTTCAGTT
          2.7 肺组织病理学观察                                        NF-κB         正向：GGACGATCTGTTTCCCCTCA   117
              取“2.4”项下各组大鼠经多聚甲醛固定 48 h 的左肺                                  反向：CCCTCGCACTTGTAACGGAA
          组织，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸渍、包埋后
                                                             TLR4、NF-κB p65一抗（稀释比例分别为1∶100、1∶400），
          切片（厚度为5 μm）；取切片适量，经脱蜡、水化后，分别
                                                             于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为
          进行 HE、Masson 和 PAS 染色。HE 染色：切片经苏木精
                                                             1∶500），于 37 ℃下孵育 30 min；以 DAB 染色后，再经苏
          染液染细胞核5 min后流水返蓝10 min，以1%伊红染液
                                                             木精复染细胞核、分化返蓝，以中性树胶封片，使用显微
          染细胞质30 s，再经梯度乙醇快速脱水、二甲苯透明后以
                                                             镜观察并采用 Image J 软件分析 TLR4、NF-κB p65 阳性
          中性树胶封片，使用生物显微镜观察其肺组织整体结
                                                             表达区域（呈棕黄色）的平均光密度，用以半定量评估上
          构、细胞形态和基本病变。Masson 三色染色：切片依次
                                                             述蛋白的相对表达量。
          经Weigert铁苏木精染液染细胞核5 min、丽春红-酸性品
                                                             2.9.2 Western blot实验
          红染液染胶原 15 min，再以 1% 磷钼酸分化后用苯胺蓝
                                                                 采 用 Western  blot 实 验 检 测 各 组 大 鼠 肺 组 织 中
          复染 5 min，同法封片后使用生物显微镜观察肺间质及
                                                             TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的表达情
          支气管血管周围胶原纤维的沉积面积和分布情况，用以
                                                             况。取“2.4”项下各组大鼠（每组3只）冻存的右肺组织，
          辅助评估气道重塑（肺纤维化）程度（每张切片随机选取
                                                             加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液，
          5 个视野，气道重塑程度通过平滑肌增厚和胶原沉积的
                                                             于冰上充分匀浆，在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min，
          增加情况来判定，二者呈正相关）。PAS 染色：切片经
                                                             收集上清液，以BCA法测定蛋白浓度后进行变性处理。
          1%高碘酸试剂氧化10 min后，加入Schiff试剂避光反应
                                                             取变性蛋白适量，经凝胶电泳分离后转膜，以5%脱脂奶
          15 min，再经苏木精染液轻度复染，同法封片后使用生物
                                                             粉封闭 2 h；洗膜后，加入 TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-
          显微镜观察气道上皮中 PAS 阳性杯状细胞数量及气道
                                                             NF-κB p65、GAPDH 一抗（稀释比例分别为 1∶1 000、1∶
          腔内黏液分泌情况，用以评估杯状细胞增生及气道黏液
                                                             1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），于 4 ℃下孵育过夜；
          分泌程度（每张切片随机选取 5～10 支终末细支气管进
                                                             洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），于室温下
          行评估）。
          2.8 肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达检测                  孵育 2 h；洗膜后，用 ECL 工作液显影、曝光、成像，使用
              采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quan‐                Alpha 软件对条带灰度值进行分析，以 TLR4、MyD88、
                                                             NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白与内参蛋白（GAPDH）的
          titative PCR，RT-qPCR）法进行检测。取“2.4”项下各组
          大鼠（每组3只）冻存的右肺组织，采用相应试剂盒方法                          灰度值比值表示上述蛋白的相对表达量。
          提取总RNA；以紫外-分光光度法测定浓度与纯度（260、                       2.10 统计学方法
          280 nm波长下的光密度比值为1.8～2.1）后，将其逆转录                        采用GraphPad Prism 10.1.2软件对数据进行统计分
          为cDNA。以所得cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体                       析。首先对所有数据进行正态性检验（Shapiro-Wilk法）
          系包括：2×Magic SYBR Mixture试剂10 µL，正、反向引              和方差齐性检验（Levene 法）。对于符合正态分布的计
          物（10 μmol/L）各2 µL，cDNA模板1 µL，加0.1%焦碳酸              量资料，以x±s表示，若同时满足方差齐性，采用单因素
          二乙酯水至 20 µL。反应条件如下：95 ℃预变性 30 s；                   方差分析进行多组间整体比较，并采用 Tukey 检验进行
          95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，进行40个循环；95 ℃终延                进一步两两比较；若符合正态分布但方差不齐，则采用
          伸 15 s。以 GAPDH 为内参，采用 2      －ΔΔCt 法计算各目的基         Welch’s ANOVA 进行整体比较，并采用 Games-Howell
          因的相对表达量。PCR引物序列及产物长度见表1。                           检验进行进一步两两比较。检验水准α＝0.05。
          2.9 肺组织中通路相关蛋白表达检测                                 3 结果
          2.9.1 免疫组化实验                                       3.1 YQWY对BA大鼠哮喘体征评分的影响
              采用免疫组化实验检测各组大鼠肺组织中 TLR4、                           与Normal组相比，Model组大鼠哮喘体征评分显著
          NF-κB p65蛋白的表达情况。取“2.7”项下各组大鼠（每                    升高（P＜0.01）。与 Model 组相比，YQWY-M、YQWY-
          组 3 只）的肺组织切片，于 60 ℃下烘烤 2 h，经二甲苯脱                   H、DEX组大鼠的哮喘体征评分均显著降低（P＜0.05或
          蜡处理及梯度乙醇水化后，进行抗原修复操作；加入                            P＜0.01）。结果见表2。


          中国药房  2026年第37卷第10期                                              China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 10    · 1267 ·
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