Page 80 - 《中国药房》2026年7期
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2.8 裸鼠移植瘤组织中caspase-3、caspase-8、caspase-9                     表1 PCR引物序列及产物长度
          酶活性检测                                               基因                     引物序列            产物长度/bp
                                                              β-actin        上游：5′-GTTGTCGACGACGAGCG-3′    93
              选取“2.3”项下每组 3 只裸鼠的移植瘤组织（约 100                                  下游：5′-GCACAGAGCCTCGCCTT-3′
          mg），置于装有液氮的研钵中，并加入蛋白裂解液，研磨                          caspase-3      上游：5′-TCGCTTCCATGTATGATCTTTG-3′  110
                                                                             下游：5′-CTGCCTCTTCCCCCATTCT-3′
          至无明显沉淀。将研磨后的混合物收集至 EP 管，离心                          caspase-9      上游：5′-CATGCTCAGGATGTAAGCCA-3′    93
          后收集上清液。按照试剂盒说明书操作，检测 caspase-                                      下游：5′-AGGTTCTCAGACCGGAAACA-3′
                                                              caspase-8      上游：5′-AGGCCAGATCTTCACTGTCC-3′  114
          3、caspase-8、caspase-9对应的OD值。将测得的OD值通                               下游：5′-GGTCACTTGAACCTTGGGAA-3′
          过标准曲线分析血浆钠（pNA）浓度，以 pNA 浓度反映                        Fas            上游：5′-GCATCTGGACCCTCCTACCT-3′  108
                                                                             下游：5′-TCCTCAATTCCAATCCCTTG-3′
          caspase 酶的活性（pNA 浓度越高，表示 caspase 酶活性                FasL           上游：5′-GCACAC AGCATCATCTTTGG-3′  109
          越强）。                                                               下游：5′-GGACCTTGAGTTGGACTTGC-3′
          2.9 裸鼠移植瘤组织中 Fas/FasL 途径相关蛋白表达                      3 结果
          检测                                                  3.1 MLCD对裸鼠移植瘤生长抑制的影响
              采用 Western blot 法检测。选取“2.3”项下每组 3 只                 与模型组比较，给药第 14 天，MLCD 高剂量组裸鼠
          裸鼠的新鲜移植瘤组织（约100 mg），置于装有液氮的研                        移植瘤体积显著缩小（P＜0.05）；给药第 21 天，MLCD
                                                              中、高剂量组裸鼠移植瘤体积均显著缩小（P＜0.05 或
          钵内，加入RIPA蛋白裂解液研磨至无沉淀，于冰浴中反
                                                              P＜0.01）；给药第 28 天，MLCD 低、中、高剂量组裸鼠移
          应 30 min，离心后弃去沉淀，获取含蛋白的上清液。使
                                                              植 瘤 体 积 均 显 著 缩 小（P＜0.05 或 P＜0.01）。 结 果
          用BCA试剂盒进行蛋白定量。通过聚丙烯酰胺凝胶电
                                                              见表2。
          泳分离蛋白，并将其电转至 PVDF 膜上，经封闭、一抗
                                                                  表2 各组裸鼠移植瘤体积比较（x±s，n＝10）
         （Fas、FasL、GAPDH 的稀释度分别为 1∶600、1∶800、1∶
                                                              组别        给药第1天   给药第7天  给药第14天  给药第21天  给药第28天
          1 000）、二抗（稀释度为 1∶2 000）反应后，进行 ECL 化学                模型组       108.84±14.72  284.11±25.43 539.44±46.51  640.49±58.53  739.98±60.41
                                                              MLCD低剂量组  112.81±12.41  280.23±24.12 517.47±47.33  601.58±61.40  680.34±56.62 a
          发光成像获取图像信息。利用成像系统自带软件分析
                                                              MLCD中剂量组  104.94±14.41  276.06±18.82 501.54±54.51  578.17±57.52 a  645.90±57.54 a
          条带灰度值，以目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带灰                          MLCD高剂量组  110.25±10.11  270.11±20.70 479.87±46.91 a  538.14±53.83 b  600.50±58.43 b

          度值的比值表示目标蛋白的相对表达水平。                                    a：与模型组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.01。
          2.10 裸鼠移植瘤组织中Fas/FasL途径、caspase凋亡途                  3.2 MLCD对裸鼠移植瘤组织中LDH含量的影响
          径相关基因mRNA表达检测                                           模型组和 MLCD 低、中、高剂量组裸鼠移植瘤组织
                                                              中的LDH含量分别为（72.91±11.23）、（104.56±12.51）、
              采用荧光定量 PCR 法检测。选取“2.3”项下每组 3
                                                             （133.45±13.30）、（176.76±14.40）（n＝3）。与模型组比
          只裸鼠的新鲜移植瘤组织（约100 mg），放入盛有液氮的
                                                              较，MLCD 各剂量组裸鼠移植瘤组织中的 LDH 含量均
          研钵中，加入 Trizol 进行研磨，直至无沉淀。采用酚-氯
                                                              显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），且呈一定的剂量依赖
          仿法提取总 RNA，使用微量紫外分光光度计测定各组
                                                              趋势。
          RNA的浓度及纯度。依照反转录试剂盒说明书，对提取
                                                              3.3 MLCD对裸鼠移植瘤组织病理形态的影响
          的总RNA反转录合成cDNA。以cDNA作为模板，按照
                                                                  模型组裸鼠移植瘤组织内细胞分布密集，经 AO 染
          荧光定量试剂盒说明书设置仪器的反应参数（95 ℃预变
                                                              色后的绿色荧光强度均匀一致，仅可见少量经 EB 染色
          性 30 s；95 ℃变性 5 s，65 ℃退火 31 s，共 40 个循环），进
                                                              的红色荧光；而在 MLCD 各剂量组中，随着 MLCD 给药
          行 PCR 荧光扩增反应。以 β-actin 为内参，采用 2           －ΔΔCt 法
                                                              剂量的增加，裸鼠移植瘤组织内细胞的紧密程度逐渐下
          计算各目标基因 mRNA 的相对表达水平。PCR 引物由
                                                              降，出现松散、碎片逐渐增多等典型的细胞凋亡形态学
          生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，PCR引                          特征，经 EB 染色后的红色荧光强度则逐渐增强。结果
          物序列及产物长度见表1。                                        见图1。
          2.11 统计学分析                                          3.4 MLCD对裸鼠移植瘤组织中线粒体膜电位的影响

              采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计量资料满足                          模型组和 MLCD 低、中、高剂量组裸鼠移植瘤组织
          正态分布，以x±s表示，多组间比较采用方差分析，进一                          中绿/红荧光强度比值分别为 7.91±0.71、12.97±1.67、
          步两两比较采用Dunnet-t检验。检验水准α＝0.05。                       18.87±3.19、32.80±4.29（n＝3）。与模型组比较，随着


          · 898 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 7                               中国药房  2026年第37卷第7期
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