Page 79 - 《中国药房》2026年7期
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A206250721、A206250814、A206250930）均购自上海碧            2.4 裸鼠移植瘤组织中LDH含量检测
          云天生物技术有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒（批                               选取“2.3”项下每组3只裸鼠的新鲜移植瘤组织（约

          号6113547）购自美国BD公司；Fas、FasL抗体（批号分别                  50 mg），放入装有液氮的研钵中研磨，直至无明显沉淀，
          为82419、15285）均购自美国Abcam公司；辣根过氧化物                   随后将研磨物收集至无菌 EP 管中。在每个 EP 管中加
          酶标记的山羊抗兔IgG、兔单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶                        入 2 mL 磷酸盐缓冲液，对各组样本进行稀释。取 150
         （GAPDH）抗体（批号分别为#12、#07）均购自美国 CST                    μL稀释后的样本加入96孔板，并对应加入反应试剂，在
          公司。                                                室温下孵育 5 min，采用酶标仪测定 450 nm 波长处的光
          1.3 细胞株及实验动物                                       密度（optical density，OD）值；同法测定标准品（丙酮酸）

              人源胃癌 AGS 细胞购自中国科学院上海细胞库。                       对应的 OD 值，绘制标准曲线。依照说明书方法测定移
          4～5 周龄的 SPF 级 BALB/c 裸鼠 40 只（雌、雄各半），购              植瘤组织中LDH的含量。
          自北京维通利华实验动物科技有限公司，生产许可证                            2.5 裸鼠移植瘤组织病理形态观察
          号：SCXK（京） 2019-0011。裸鼠饲养在贵州中医药大学                       选取“2.3”项下每组3只裸鼠的新鲜移植瘤组织（约
          实验动物研究所SPF级动物房（实验温度20～26 ℃，相                       20 mg），用组织固定液固定，经脱水、石蜡包埋、切片处
          对湿度 40%～70%，每 12 h 光暗循环，自由摄食、饮水），                  理后，将切片捞至载玻片上，置于烤箱中烤干。随后进

          使用许可证号：SYXK（黔）2021-0005。本研究动物实验                    行脱蜡和水化，制成待测组织切片。向各组切片滴加通
          方案获得贵州中医药大学实验动物伦理审查委员会批                            透液，于室温下反应10 min。将预先配制好的AO-EB染
          准（编号：20230268），实验过程中实验动物按照3R原则                     色液分别滴加至各组白片上，室温避光反应 15 min，以
          给予人道关怀。                                            磷酸盐缓冲液洗掉染色液，滴加防淬灭树脂胶封片；采
          2 方法                                               用荧光显微镜观察移植瘤组织的病理形态并拍照。

          2.1 MLCD药液的制备                                      2.6 裸鼠移植瘤组织中线粒体膜电位检测
              取“1.2”项下 12 种药材饮片（饮片混合后的总质量                        选取“2.3”项下每组3只裸鼠的新鲜移植瘤组织（约
          为 240 g），采用回流提取法制备 MLCD，药物的成分鉴                     20 mg），依照“2.5”项下方法制成组织切片。向各组切片
          定及其冻干粉的具体制备过程参考本课题组前期研                             滴加通透液，于室温下反应 10 min。将预先配制好的
          究 [6―7] ；随后用生理盐水将冻干粉稀释成质量浓度为100                    JC-1 染色液分别滴加至各组切片，于 37 ℃避光孵育 30
          mg/mL的MLCD药液以备后续使用。                                min。滴加洗涤液对染色玻片漂洗3次，用磷酸盐缓冲液
          2.2 建模、分组及给药                                       冲洗，滴加防淬灭树脂胶封片。采用荧光显微镜观察组

              裸鼠适应性饲养 1 周后，把处于对数生长期的人源                       间颜色变化，以绿/红荧光强度比值反映线粒体膜电位的
          胃癌 AGS 细胞以 3×10  mL 的浓度接种至 40 只裸鼠                  变化（当绿/红荧光强度比值升高时，表示细胞线粒体膜
                              7
                                  －1
          的左前肢腋下，每只裸鼠接种量为0.2 mL。观察裸鼠的                        电位降低）。
          成瘤情况，当接种处肉眼可见明显结节时，表明已成瘤，                          2.7 裸鼠移植瘤组织中ROS含量检测
          即裸鼠移植瘤模型构建成功。将 40 只建模成功的裸鼠                             选取“2.3”项下每组 3 只裸鼠的移植瘤组织（约 50

          分为模型组和 MLCD 低、中、高剂量组，每组 10 只。                      mg），放入装有液氮的研钵中研磨，以获取组织的细胞悬
          MLCD 低、中、高剂量组裸鼠根据前期预实验结果并结                         液，并收集到离心管中。将提前配制好的 DCFH-DA 荧
          合 实 验 动 物 体 重 ，分 别 给 予 150、300、600  mg/kg 的        光探针添加至细胞悬液，于 37 ℃避光孵育 30 min。随
          MLCD药液；模型组裸鼠给予等体积蒸馏水。裸鼠每天                          后加入磷酸盐缓冲液进行清洗，接着离心并弃去上清
          灌胃1次，连续4周。                                         液，重复清洗3次。最后用磷酸盐缓冲液溶解，均匀铺在
          2.3 裸鼠移植瘤体积的测定                                     24 孔板中。在酶标仪荧光模块下，设定激发波长为 488
              从给药第 1 天起每隔 6 d 测量 1 次各组裸鼠的肿瘤                  nm、发射波长为 525 nm，检测各组样本的荧光强度值。

          大小（长径、短径），并计算移植瘤体积[移植瘤体积＝1/2                       以模型组荧光强度值为对照，对各组荧光强度数据进行
                     2
         （长径×短径 ）]用以评估移植瘤的生长情况。给药结束                          归一化处理后，得 ROS 的相对荧光强度，以此反映 ROS
          后处死裸鼠，立即分离肿瘤组织保存备用。                                含量（相对荧光强度越大，表示ROS含量越高）。


          中国药房  2026年第37卷第7期                                                 China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 7    · 897 ·
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