Page 61 - 《中国药房》2025年18期
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结肠内滴注4%乙酸溶液1 mL（抬高尾巴的同时按压其                         2.6 结肠组织病理学变化观察
          肛门，以保证溶液充分进入大鼠体内，持续60 s）；与此同                           采血完成后，各组大鼠以颈椎脱位法处死，分离其
          时，大鼠每天进行束缚应激，即将其置于自制的束缚笼                           结肠，取一部分冻存，备用。取另一部分，用生理盐水洗
          中限制活动1 h后再进行5 min的夹尾操作，随后再将大                       涤后固定在4%多聚甲醛溶液中，经脱水后以石蜡包埋，
          鼠置于饲养笼中自由活动，共持续 8 d。若大鼠腹壁撤                         切片（厚约 5 μm）。取切片，经干燥、脱蜡后，依次用苏
          退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）评分（包括无         木精、伊红染色，经脱水、封片后，使用倒置显微镜观察
          反应的正常行为、腹肌收缩、腹壁抬高、背弓和骨盆结构                          其结肠组织病理学变化。
          抬高评分）不低于3分，且粪便性状评分、粪便含水量均                          2.7 结肠组织中紧密连接蛋白、闭合蛋白 mRNA 表达
          显著高于对照组，则表示 IBS-D 模型构建成功                [9―10] 。对
                                                             检测
          照组大鼠以生理盐水替代乙酸溶液灌肠，且不进行束缚
                                                                 采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，
          应激。
                                                             RT-qPCR）法检测。取“2.6”项下各组大鼠冻存的结肠组
              将造模成功的大鼠随机分为 IBS-D 组、中药组、阳
                                                             织适量，以 TRIzol 试剂提取总 RNA，待测定浓度和纯度
          性对照药组、激活剂组、中药+激活剂组，每组10只。其
                                                             后，将其逆转录为 cDNA，然后以此 cDNA 为模板进行
          中，中药组大鼠灌胃15 g/kg（以生药总量计）的黄芪建中
                                                             PCR 扩增。PCR 反应体系包括 cDNA 模板（2 μL），
          汤 ，并同时尾静脉注射等体积生理盐水；阳性对照药
            [11]
                                                             SYBR Premix Ex TaqⅡ聚合酶（9 μL），正、反向引物（各
          组大鼠灌胃 150 mg/kg 的利福昔明片药液（以水为溶
             [12]
          剂） ，并同时尾静脉注射等体积生理盐水；激活剂组大                          0.3 μL），ddH2O（8.4 μL）。PCR 反应条件为：95 ℃预变
                                          [13]
          鼠尾静脉注射125 μg/kg的anisomycin ，并同时灌胃等                 性 30 s；95 ℃变性 5 s，62 ℃退火、延伸 20 s，共 40 个循
          体积生理盐水；中药+激活剂组大鼠灌胃15 g/kg的黄芪                       环。以 β-actin 为内参，采用 2     －ΔΔCt 法计算紧密连接蛋白
          建中汤，并同时尾静脉注射 125 μg/kg 的 anisomycin；对              ZO-1、闭合蛋白（occludin）mRNA 的表达水平。β-actin
          照组和 IBS-D 组大鼠灌胃并同时尾静脉注射等体积生                        的正向引物为 5′-GAAGTGTGACGTTGACATCCG-3′，
          理盐水。所有大鼠每天灌胃/尾静脉注射1次，连续2周。                         反向引物为 5′-GATCCACATCTGCTGGAAG-3′，产物
          2.3 粪便含水量计算及粪便性状评分评估                               长度为 94 bp；ZO-1 的正向引物为 5′-ATTCAGGTCG-
              末次给药后，收集各组大鼠的24 h粪便，立即称重，                      CTCGCATGAC-3′，反向引物为 5′-ACTGCGTGGAAT-
          得湿重；随后，于 80 °C 下干燥 10 h，再次称重，得干重；                  GATCGGAG-3′，产物长度为 114 bp；occludin 的正向引
          以“（粪便湿重－粪便干重）/粪便湿重×100%”计算粪便                       物为5′-CTCGGTACAGCAGCAATGGT-3′，反向引物为
          含水量。                                               5′-GGCTTCCTGTTGGTGATGTC-3′，产物长度为105 bp。
              末次给药后的当天，观察各组大鼠的排便情况并进                         2.8 结肠组织中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达
          行粪便性状评分，具体标准为：大便干硬，排出较为困                           检测
          难，记 1 分；大便成形，呈团状块，记 2 分；大便表面有裂                         采用Western blot法检测。取“2.6”项下各组大鼠冻
          缝，呈香肠状，记3分；大便柔软，呈香肠状，记4分；大便                        存的结肠组织适量，经裂解、匀浆后，于冰上超声，提取
          容易排出，呈软团状块，记5分；大便为糊状，边缘毛躁，                         结肠组织中的总蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度后，于
                                        [8]
          记6分；水样便，无固定形状，记7分 。
                                                             100 °C 下煮沸、变性。取变性蛋白，进行 10% 十二烷基
          2.4 最小容量阈值检测
                                                             硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至聚偏二氟
              收集粪便后，各组大鼠均禁食18 h，以戊巴比妥（30
                                                             乙烯膜上，封闭；洗膜后，加入p-p38 MAPK、p-NF-κB p65、
          mg/kg）腹腔注射麻醉后，将经石蜡油润滑的球囊导管轻
                                                             p38 MAPK、NF-κB p65、β-actin 一抗（稀释比例均为
          轻插入其肛门，并将连接的管子用胶带固定在大鼠的尾
                                                             1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀
          巴上，待大鼠适应 30 min 后将其放入透明容器中，通过
                                                             释比例均为1∶2 000），于室温下孵育2 h；洗膜后，加入电
          导管将水注射至球囊中，每次注射持续30 s。当大鼠腹
                                                             化学发光试剂显影、成像。使用 Image J 软件分析和量
          肌强烈收缩、腹部明显抬离平面、AWR评分为3分时，记
                                                             化图像，以 β-actin 为内参，以各目的蛋白与内参蛋白的
          录对应的注水量，即为最小容量阈值，以评估大鼠的内
          脏敏感性（两者成反比） 。                                      灰度值比值作为目的蛋白的表达水平，再以p-p38 MAPK
                              [12]
          2.5 血清中炎症因子水平检测                                    与p38 MAPK、p-NF-κB p65与NF-κB p65的表达水平比
              上述检测完成后，各组大鼠同法麻醉后，以仰卧位                         值作为p38 MAPK、NF-κB p65蛋白的磷酸化水平。
          固定，打开其腹腔，经腹主动脉取血（5 mL）。血样以                         2.9 统计学方法
          4 500 r/min 离心 5 min，分离上层血清，按相应试剂盒说                    采用SPSS 27.0软件对数据进行统计分析。实验数
          明书操作，采用酶标仪检测其血清中TNF-α、IL-1β、IL-6                   据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
          水平。                                                步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。


          中国药房  2025年第36卷第18期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 18    · 2275 ·
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