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2.3 安五脂素的抗炎活性研究                                     照组、LPS 模型组、LPS+安五脂素组，每组设置 5 个复
          2.3.1 安五脂素对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞生长的                  孔。除正常对照组加入等体积培养液外，其余各组均加
          影响                                                  入 1 μg/mL 的 LPS 刺激 1 h，LPS+安五脂素组再分别加
              采用MTT法检测。用含10%胎牛血清的DMEM不                        入质量浓度为0.5、0.25、0.125 μg/mL的安五脂素。培养
          完 全 高 糖 培 养 基 于 5%CO2、37  ºC 培 养 箱 中 培 养            24 h 后，以 800 r/min 离心 3 min，收集上清液，按试剂盒
          RAW264.7 细胞至对数生长期。实验分为空白对照组、                        说明书操作，检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。采
          正常对照组、LPS 模型组、安五脂素组、LPS+安五脂素                        用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，数据以 x±s
          组。除空白对照组只加入培养基外，其余各组均按 8×                           表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用
            4
          10 个/mL 将细胞接种至 96 孔培养板中，每孔 100 μL。                  LSD-t检验，检验水准α＝0.05。结果见表2。
          待细胞生长至 80% 融合后，正常对照组不进行任何处                          表2 各组细胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比较
          理，LPS 模型组以 1 μg/mL 的 LPS 刺激 1 h，安五脂素组                   （x±s，n＝5，pg/mL）
          以不同质量浓度（0.125、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 μg/mL，          组别      安五脂素质量浓度/（μg/mL）  TNF-α  IL-1β    IL-6
                                                              正常对照组                 177.34±6.38  2.76±0.47  15.29±0.96
          依据预实验设置，下同）的安五脂素处理，LPS+安五脂素                         LPS模型组                370.35±8.71 a  7.65±0.69 a  554.79±12.42 a
          组用 LPS（1 μg/mL）刺激 1 h 后再以上述质量浓度的安                   LPS+安五脂素组    0.125    350.62±6.43 b  6.24±0.25 b  292.37±7.74 c
          五脂素处理。每组设5个复孔。培养24 h后，各孔加入                                       0.25     291.21±7.69 c  5.11±0.38 c  156.12±6.59 c
                                                                           0.5      283.64±5.17 c  3.03±0.53 c  100.47±3.12 c
          5 mg/mL的MTT 20 μL，避光孵育4 h，弃上清液，加入二
                                                                 a：与正常对照组比较，P＜0.01；b：与LPS模型组比较，P＜0.05；c：
          甲基亚砜150 μL，振摇10 min，使用酶标仪在490 nm波                   与LPS模型组比较，P＜0.01。
          长处检测其光密度（optical density，OD），按以下公式计                     如表2结果显示，与正常对照组比较，LPS模型组细
          算细胞存活率：细胞存活率（%）＝（实验组OD值－空白                          胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均显著升高（P＜
          对照组 OD 值）/（正常对照组 OD 值－空白对照组 OD                      0.01）；与 LPS 模型组比较，LPS+安五脂素 0.125、0.25、
          值）×100%。结果见图4。                                      0.5 μg/mL组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显

                150                                           著降低（P＜0.05或P＜0.01）。
                            a                 安五脂素组
                       a        a   a
                                              LPS+安五脂素组       3 讨论
               细胞存活率/%                a  a  a  a              3.1 提取方法的优化
                100
                                                                  本研究考察了浸渍法、超声法、回流法对小钻提取
                 50
                                          a
                                              a               效果的影响，结果显示，回流法的有效成分提取较完全；
                                                  a a         其次本研究考察了石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、正丁
                 0
                正常对照组     0.125     0.25            0.5         0.75       1.0         1.25       1.5  醇、乙醇 6 种提取溶剂对小钻提取效果的影响，结果显
                   LPS模型组
                               安五脂素质量浓度/（μg/mL）
                                                              示，乙醇的提取效率最高；最后本研究还考察了乙醇体
             a：与正常对照组比较，P＜0.01。
          图4 安五脂素对LPS诱导的RAW264.7细胞生长的影                        积分数（65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%）、料液比
               响（x±s，n＝5）                                    （1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，g/mL）、回流时间（1、2、3 h）和
                                                              回流次数（1、2、3、4 次）对小钻提取效果的影响，最终确
              如图4显示，与正常对照组比较，LPS模型组细胞存
                                                              定 2 g 小钻用 80% 乙醇 20 mL 回流提取 2 h，提取 3 次的
          活率显著升高（P＜0.01），表明LPS对RAW264.7细胞生
                                                              提取方法。
          长具有明显的抑制作用；与正常对照组比较，当安五脂                            3.2 色谱条件的选择
          素质量浓度≤0.5 μg/mL 时，安五脂素组细胞存活率无                           本研究以峰数和分离度为考察指标，分别对不同的
          明显变化（P＞0.05），而 LPS+安五脂素组细胞存活率均                      色谱柱[依利特 Hypersil ODS C18 （250 mm×4.6 mm，5
          显著升高（P＜0.01）；但是当安五脂素质量浓度≥0.75                       μm）和Diamonsil C18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）]、流动相
          μg/mL 时，安五脂素组和 LPS+安五脂素组细胞存活率                       体系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸溶液）、检测波长
          均显著降低（P＜0.01）。由此可见，在安五脂素质量浓                        （210、254、280、290 nm）进行了考察。结果表明，在依利
          度 不 高 于 0.5  μg/mL 时 ，其 单 用 和 与 LPS 联 用 均 对         特Hypersil ODS C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱、乙
          RAW264.7 细胞无明显毒性，故本研究选择 0.125、0.25、                 腈-0.5% 磷酸溶液流动相、210 nm 检测波长的色谱条件
          0.5 μg/mL的安五脂素进行后续实验。                               下，小钻的各色谱峰分离度良好、特征性强、峰数较多。
          2.3.2 安五脂素对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞中 TNF-α、              3.3 特征图谱及含量结果分析
          IL-1β、IL-6水平的影响                                         本研究从建立的小钻药材 HPLC 特征图谱中标定
              采用 ELISA 法检测。将对数生长期细胞按 8×10                4    了9个共有峰，指认了3个成分，分别为长南五味子素E、
          个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。实验分为正常对                       南五味子内酯 A 和安五脂素。10 批广西不同产地小钻


          · 1730 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 14                            中国药房  2024年第35卷第14期
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