Page 38 - 《中国药房》2024年10期
P. 38

2.2 大鼠分组、建模与给药                                      源性过氧化氢酶，用 3% 牛血清白蛋白室温封闭 1 h，
              大鼠适应性喂养 1 周后，按照随机数字表法分为假                        然后滴加 BNIP3、Beclin-1 一抗（稀释比分别为 1∶200、
          手术组（10 只）及造模组（40 只）。参照文献及本课题组                       1∶100），于4 ℃孵育过夜；以PBS洗涤后滴加二抗（稀释
                      [7]
          既往建模方法 ，采用双上肢去势联合椎间盘刺破纤维                            比为 1∶200），DAB 显色，苏木精复染 3 min，经乙醇梯度
          环的方式建立LDH大鼠模型。术后2 d（干预前），每组                         脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在显微镜下每张切
          随机选取2只大鼠，进行磁共振成像（MRI）扫描检查，大                         片随机选取 3 个视野，采用 Image J 软件分析 BNIP3、
          鼠 L4-L5、L5-L6 髓核呈低信号、与纤维环界限模糊即为                     Beclin-1阳性细胞百分比（以棕黄色为阳性表达）。
          LDH 造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组、                           2.8 大鼠椎间盘组织中 NF-κB p65、p-NF-κB p65、
          NF-κB抑制剂组（QNZ组）、YQHX组及联合组（YQHX+
                                                              TRAF-2、TRAF-3、BNIP3及LC3B蛋白表达检测
          QNZ组），每组10只。术后3 d，按照人与大鼠体表面积
                                                                  采用蛋白质印迹法检测。取“2.4”项下各组 3 只大
          换算公式计算给药剂量，QNZ 组大鼠腹腔注射 1 mg/kg
                                                              鼠冻存的椎间盘组织，以蛋白裂解液裂解，用BCA法测
          QNZ，YQXH 组大鼠灌胃 9.1 g/kg（以生药量计，前期研
                                                              定蛋白浓度后于 95 ℃变性 10 min。取变性蛋白，电泳
                               [8]
          究证实的最佳干预剂量 ）YQHX，YQHX+QNZ 组大鼠
                                                              分离，转至聚偏二氟乙烯膜上，以5%脱脂奶粉封闭2 h，
          同时灌胃 YQHX（9.1 g/kg）及腹腔注射 QNZ（1 mg/kg），
                                                              加 入 NF- κB  p65、p-NF- κB  p65、TRAF-2、TRAF-3、
          假手术组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天给药
                                                              BNIP3、LC3B 及 β-actin（内参蛋白）一抗（目的蛋白稀释
          1次，连续8周。
                                                              比均为1∶1 000，内参蛋白稀释比为1∶10 000），于4 ℃孵
          2.3 大鼠椎间盘突出严重程度评估
                                                              育过夜；洗膜后加入二抗（稀释比为1∶10 000），于37 ℃
              末次给药结束 24 h 后，每组随机取 3 只大鼠，经 4%
                                                              孵育 1 h 后，以 ECL 化学发光液显色，采用 Image J 软件
          异氟烷诱导麻醉，然后进行MRI扫描检查，在T2WI序列
          下对 L4-L5、L5-L6椎间盘突出严重程度进行 Pfirrmann 分               对目的蛋白的表达水平进行定量分析，以目的蛋白与内
          级评分 。                                               参蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平，再以
                [9]
          2.4 样品采集及大鼠椎间盘组织形态学观察                               p-NF-κB p65 与 NF-κB p65 蛋白的表达水平比值表示
              MRI 扫描结束后，各组大鼠于腹主动脉采血 3 mL，                     NF-κB p65磷酸化水平。
          以 3 500 r/min 离心 15 min，分离上层血清，于－80 ℃保              2.9 大鼠椎间盘组织中NF-κB p65、LC3B、p62、BNIP3
          存，备用。大鼠脱颈处死，取下附带椎骨的L4-L5、L5-L6椎                     及Beclin-1 mRNA表达的检测
          间盘，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，于－80 ℃保存，备                            采用实时定量 PCR 法检测。取“2.4”项下各组 3 只
          用；随机选取6只大鼠椎间盘组织，置于4%多聚甲醛固                           大鼠冻存的椎间盘组织，采用柱提法提取总 RNA，并将
          定后，脱钙、石蜡包埋，制成4 μm切片。每组随机选取3                         其反转录成cDNA进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃
          张切片，HE 染色后，常规脱水、透明、封片，在显微镜下                         预变性30 s；95 ℃变性30 s，60 ℃退火延伸15 s，共40个
          观察大鼠的椎间盘组织形态学变化并采集图像。                               循环，12 ℃保温 40 min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gly-
          2.5 大鼠髓核细胞自噬观察                                      ceraldehyde-3-phosphate  dehydrogenase，GAPDH）为 内
              取“2.4”项下各组大鼠椎间盘组织切片，用PBS冲洗                      参，根据 2  －ΔΔCt 法计算 NF-κB p65、LC3B、p62、BNIP3 及
          后，以3%戊二醛和1%锇酸固定5 h，然后样品用环氧树
                                                              Beclin-1 mRNA的表达水平。PCR引物序列及扩增产物
          脂包埋，制成50 nm超薄切片。每组随机选取3张切片，
                                                              见表1。
          再用2%醋酸铀和0.2%柠檬酸铅染色后，在透射电子显
                                                                          表1 引物序列及扩增产物
          微镜下观察髓核细胞自噬情况并采集图像。
                                                              基因         引物序列（5′→3′）                扩增产物/bp
          2.6 大鼠血清中TNF-α水平检测                                  GAPDH      正向引物TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC  185
              取“2.4”项下各组大鼠的血清样品，解冻后，按照                                   反向引物ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC
                                                              NF-κB p65  正向引物AGTGTTCACAGACCTGGCATC    256
          ELISA 试剂盒说明书操作，以酶标仪检测大鼠血清中                                     反向引物TCACCAGGCGAGTTATAGCTT
          TNF-α在450 nm波长处的吸光度值，利用标准曲线计算                       LC3B       正向引物TGTATCCACACCCATCGCTGACA  178
                                                                         反向引物CTGACCAGAACTCCCAGCCACC
          TNF-α水平。
                                                              p62        正向引物CCTGAACTCATGGCTGAGA      183
          2.7 大鼠椎间盘组织中 BNIP3、Beclin-1 阳性细胞百分                             反向引物GTCCAAATAATTCTCCTCGTCATC
          比检测                                                 BNIP3      正向引物CTGTCTCATCTGTTAGCCATTG   237
                                                                         反向引物CACAGCTCAGCGTGAATC
              采用免疫组织化学法检测。取“2.4”项下各组 3 只                      Beclin-1   正向引物ATGCACAGATACTCTTTTAGACC  280
          大鼠椎间盘组织切片，常规脱水，用3%过氧化氢阻断内                                      反向引物AACAGCGTTTGTAGTTCTGACA


          · 1188 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 10                            中国药房  2024年第35卷第10期
   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43