Page 71 - 《中国药房》2024年9期
P. 71

自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG                       （paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。每次测
          二抗（批号 230106）购自美国 Thermo Fisher Scientific         试间隔时间大约2 min，重复3次，取平均值。

          公司。                                                    热痛觉过敏测定：上述实验结束后采用热痛仪测试
          1.3 主要仪器                                           大鼠后爪足底的热敏感性，若大鼠出现缩足情况即为阳
              本研究所用主要仪器有 Multiskan GO 型全自动酶                  性反应，将开始刺激到出现阳性反应的时间记为热刺激
          标仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）、CX23 型光学        缩 足 反 射 潜 伏 期（paw  withdrawal  thermal  latency，
          显微镜（日本Olympus公司）、DM IL LED型荧光显微镜                   PWTL）。热刺激时间为10～15 s，上限为20 s，以防止组
         （德国 Leica 公司）、Ugo Basile 型足底热痛仪（上海玉研                织损伤。每次测试间隔5 min，重复3次，取平均值。
          科学仪器有限公司）。                                         2.4 样本取材
          2 方法                                                   痛觉实验结束后，麻醉处死大鼠，心脏取血，离心取

          2.1 动物分组、造模与给药                                     上清，保存于－20 ℃用于 TNF-α、IL-1β、5-HT、NPY 检
              随机选取10只大鼠作为对照组，剩余大鼠参照文献                        测。取血完成后，解剖大鼠，将椎旁肌与腰椎节段分离，
          [7]构建 LDH 模型，具体操作如下：麻醉大鼠，将背部和                      切除椎间盘纤维环，暴露 L4～L6 节段髓核组织；收集
          腹部脱毛，在距肛门约 1 cm 的尾根处切一个 3～3.5 cm                   DRG 组织，一部分固定于 4% 多聚甲醛中，其余部分冷
          长的切口，从第二和第三椎骨之间的尾椎间盘中取出髓                           冻并保存在－80 °C。
          核。在背侧切开内侧纵切口，依次剥离皮肤、皮下组织                           2.5 大鼠DRG组织的病理学形态观察
          和腰背筋膜，沿旋突左侧将骶棘肌剥离并分离，切断左                               将 DRG 组织于 4 °C 条件下固定于 4% 多聚甲醛中
          侧L4至L5椎板、关节突和部分椎弓根，暴露左侧神经根                         48 h，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后经乙醇梯度脱水、二甲
          以及 L4、L5 相应的 DRG，将自体髓核放入硬膜外腔，缝                     苯透明、石蜡包埋后，切成4 μm薄片；取部分切片（剩余

          合伤口。对照组大鼠暴露神经根，切除尾椎髓核，不进                           部分用于免疫荧光实验）进行HE染色后，置于显微镜下
          行移植。术后3 d静脉注射青霉素防止感染。当造模大                          观察DRG组织的病理变化。
          鼠出现精神萎靡、行走缓慢、后肢跛行等行为时表明造                           2.6 大鼠血清中炎症因子和疼痛因子水平的检测
          模成功 。将造模成功的大鼠分为模型组和 SG 低、中、                            采用 ELISA 法进行检测。取－20 ℃保存的大鼠血
                [8]
          高剂量组以及 SG 高剂量+Anisomycin 组，每组 10 只。                清，按照 ELISA 试剂盒说明书，检测炎症因子 TNF-α、
          SG 低、中、高剂量组大鼠分别于腹腔注射 1.00、2.50、                    IL-1β和疼痛因子5-HT、NPY的水平。
                      [3]
          6.25 mg/kg SG ，SG高剂量+Anisomycin组大鼠在腹腔注             2.7 大鼠脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况的
                                                       [9]
          射6.25 mg/kg SG的同时腹腔注射Anisomycin 5 mg/kg ，          观察
          对照组和模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，每天 1                              采用免疫荧光法进行观察。取“2.5”项下剩余切片，
          次，连续7 d。                                           以PBS洗涤后，透化30 min；以7%驴血清封闭1 h后，与
          2.2 大鼠一般情况及神经功能变化观察                                一抗Iba-1（稀释度为1∶500）、GFAP（稀释度为1∶500）在
              末次给药结束后，观察各组大鼠一般情况，包括毛                         4  °C孵育过夜；洗涤后与二抗（稀释度为1∶400）在室温
          发、饮食、体重、运动情况等，并参考文献[10]对其神经功                       下孵育45  min，以DAPI处理切片后，在荧光显微镜下观
          能进行评分：0 级（2 分），正常；1 级（4 分），步态基本正                   察切片并采集图像，采用Image Pro Plus软件分析Iba-1、
          常，足趾异常；2级（6分），左后肢无力，轻度跛行；3级（8                      GFAP 蛋白（镜下均呈绿色荧光）的荧光强度。Iba-1 蛋
          分），左后肢无力，跛行明显；4级（10分），站立不稳，左后                      白荧光强度越高，表明脊髓小胶质细胞活化程度越高；
          肢活动；5级（12分），左后肢瘫痪，不能自主活动。                          GFAP 蛋白荧光强度越高，表明星形胶质细胞活化程度
          2.3 大鼠疼痛阈值检测                                       越高。

              机械性痛觉过敏测定：“2.2”项下实验结束后通过                       2.8 大鼠DRG组织中MAPK/ERK/NF-κB信号通路相
          Von Frey纤维丝测试大鼠右足机械痛阈。将大鼠固定于                       关蛋白和炎症相关蛋白表达检测
          安静环境，施加足够的力将Von Frey纤维丝垂直刺激大                           采用Western blot法进行检测。取各组大鼠DRG组
          鼠后爪表面6～8 s，若出现爪子迅速缩回、舔爪子或嚎叫                        织适量，经裂解液裂解后，取30 μg蛋白样品进行变性处
          即为阳性反应，将该力记为机械刺激缩足反射阈值                             理，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转


          中国药房  2024年第35卷第9期                                                China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 9    · 1089 ·
   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76