Page 73 - 《中国药房》2023年19期

水、包埋切片（厚度为 5 μm）、脱蜡和水化后进行 HE 染
色，最后在显微镜下观察大鼠骨组织损伤并分析新生血
管数量和面积。
2.5 大鼠股骨中PECAM-1表达情况检测
采用免疫荧光染色法检测大鼠股骨中PECAM-1表
达。取“2.2”项下大鼠左侧股骨，经固定、脱钙、包埋切片
（5 μm）、磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗后加入 PECAM-1 一
抗，4 ℃避光孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗 200 μm 200 μm 200 μm
兔 IgG 二抗，室温下避光孵育 1 h，经 PBS 洗涤、DAPI 避 A. Sham组 B. Model组 C. Gal低剂量组
光复染 5 min、封片后，采用荧光显微镜观察并拍摄照
片。采用Image J软件计算PECAM-1的平均荧光强度。
2.6 大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2含量测定
采用 ELISA 法进行检测。取每组剩余的 6 只大鼠
的腹主动脉血，以3 000 r/min离心15 min，取上层血清，
根据试剂盒说明书方法检测大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、
BMP-2的含量。
2.7 大鼠骨痂组织中 ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表达 200 μm 200 μm 200 μm
检测 D. Gal中剂量组 E. Gal高剂量组 F.抑制剂组
采用Western blot法进行检测。麻醉处死“2.6”项下 图1 各组大鼠股骨Micro-CT结果
取血后的大鼠，提取其骨痂组织中的总蛋白，通过 BCA 表1 各组大鼠股骨显微结构指标的比较（x±s，n＝6）
法测定总蛋白浓度。将蛋白高温变性，取120 μg变性蛋 组别 BMD/（mg/cm） BV/TV/% Tb.N/（1/mm） Tb.Th/μm
3
白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压120 Sham组 252.38±24.65 46.58±3.91 3.98±0.75 57.96±4.98
V，电泳时间 60 min），转膜（电流 250 mA，转膜时间 60 Model组 156.31±14.87 a 31.74±3.17 a 2.25±0.53 a 43.28±3.51 a
Gal低剂量组 174.08±15.49 b 34.56±3.58 b 2.76±0.49 b 46.73±4.68 b
min），以5%脱脂奶粉室温封闭2 h；分别加入ALP（稀释 Gal中剂量组 204.31±18.36 bc 38.94±3.84 bc 3.29±0.57 bc 51.48±4.73 bc
比例1∶1 000）、HIF-1α（稀释比例1∶2 000）、VEGF（稀释 Gal高剂量组 235.62±19.72 bcd 43.16±3.76 bcd 3.76±0.61 bcd 55.93±4.21 bcd
抑制剂组 185.93±16.54 e 35.89±3.29 e 2.85±0.48 e 46.85±3.94 e
比例1∶1 000）、GAPDH（稀释比例1∶1 000）一抗，4 ℃孵
a：与Sham组比较，P＜0.05；b：与Model组比较，P＜0.05；c：与Gal
育过夜；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG
低剂量组比较，P＜0.05；d：与Gal中剂量组比较，P＜0.05；e：与Gal高剂
二抗（稀释比例1∶2 000），室温孵育90 min；洗膜后，采用 量组比较，P＜0.05。
ECL 发光显影。以 Image J 软件分析蛋白条带的灰度 Model 组比较，Gal 低、中、高剂量组大鼠股骨最大负载
值，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比 [分别为（27.36±2.84）、（32.54±3.17）、（37.83±3.69） N]
值表示目的蛋白的相对表达水平。
均显著升高（P＜0.05），且具有明显的剂量依赖性；与
2.8 统计学方法
Gal 高 剂 量 组 比 较 ，抑 制 剂 组 大 鼠 股 骨 最 大 负 载
实验数据用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分
[ （28.46±2.75） N]显著降低（P＜0.05）。
析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
3.3 Gal对大鼠骨组织病理损伤的影响
分析，两组间比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
Sham组大鼠骨组织中骨小梁数量多、较粗、致密分
3 结果
布；与 Sham 组比较，Model 组大鼠骨组织中骨小梁数量
3.1 Gal对大鼠股骨显微结构的影响
减少、变薄、间隙增大、结构较乱和疏松，新生血管数量
与 Sham 组比较，Model 组大鼠股骨 BMD、BV/TV、
和血管面积均显著减少/减小（P＜0.05）；与 Model 组比
Tb.N、Tb.Th 均显著降低（P＜0.05）；与 Model 组比较，
Gal低、中、高剂量组大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 较，Gal 低、中、高剂量组大鼠骨组织中骨小梁数量和厚
均显著升高（P＜0.05），且具有明显的剂量依赖性；与 度明显改善、间距减小、结构更密集、排列整齐，新生血
Gal 高剂量组比较，抑制剂组大鼠股骨 BMD、BV/TV、 管数量和血管面积均显著增多/增大（P＜0.05），且具有
Tb.N、Tb.Th均显著降低（P＜0.05）。结果见图1、表1。 明显的剂量依赖性；与Gal高剂量组比较，抑制剂组大鼠
3.2 Gal对大鼠股骨生物力学的影响 骨组织中骨小梁数量减少、变细、间距增大、结构较为疏
与 Sham 组[（49.48±3.76） N]比较，Model 组大鼠股 松，新生血管数量和血管面积均显著减少/减小（P＜
骨最大负载[（23.68±2.59） N]显著降低（P＜0.05）；与 0.05）。结果见图2和表2。

中国药房 2023年第34卷第19期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 19 · 2367 ·