Page 75 - 《中国药房》2023年11期
P. 75
减方高、中、低剂量组（以生药计分别为 6.0、3.0、1.5 98%A；11～14 min，98%A；14～16 min，98%A→5%A）；
g/kg，分别为人临床等效剂量的 4、2、1 倍），每组 10 只。 流速为0.3 mL/min；柱温为45 ℃；进样量为5 μL。质谱
各给药组大鼠灌胃相应药物，给药体积均为 10 mL/kg； 条件为：采用电喷雾离子源，在正、负离子扫描模式下检
空白组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水。每天给药1 测；毛细管电压与锥孔电压分别为2.5 kV、120 V；离子源
次，连续给药14 d。末次给药后，除空白组外，其余各组 温度为110 ℃；脱溶剂温度为350 ℃；扫描范围为质荷比
[9]
大鼠均腹腔注射 LPS 10 mg/kg 建立脓毒症模型 ，空白 （m/z）50～1 500；喷雾频率为30 s。
组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。造模后观察并记录 2.6.2 潜在生物标志物及通路分析 将“2.6.1”项下收
各组大鼠的体征表现。通过大鼠体征表现及血清指标 集到的质谱数据通过Progenesis QI软件转换为文件数据，
综合判断造模成功情况。 明确数据中代谢物的分子量，筛除所获数据中外源性干
2.3 样本收集与处理 扰成分后导入SIMCA-P 13.0软件进行偏最小二乘判别分
造模 12 h 后，将大鼠麻醉，腹主动脉取血后处死。 析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。
血样凝固后取上层血清，于－80 ℃冻存；同时，迅速取出 采用变量重要性投影（variable importance in projection，
[11]
大鼠肝组织，用生理盐水洗去浮血后，滤纸吸干，在冰浴 VIP）＞2 作为投射筛选条件 ，找出重要生物标志物。
上取适量肝组织剪成碎片，加入9倍体积冰冷的甲醇进 运用 MetaboAnalyst 5.0 数据库、人类代谢组学数据库
行匀浆。匀浆液在 4 ℃条件下以 13 000 r/min 离心 15 （human metabolome database，HMDB）（https：//hmdb.ca）
min，取上清液存于离心管中，重复上述条件离心1次，将 和京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclope‐
上清液于－80 ℃冻存，用于代谢组学分析。取大鼠盲肠 dia of Genes and Genomes，KEGG），最终鉴定出相关代
[12]
末端内容物存于冻存管中，用液氮速冻后，立即于－80 ℃ 谢产物所对应的代谢通路 。
冻存，用于菌群16S rRNA测序分析。 2.7 统计学方法
2.4 血清中炎症指标和肝功能指标检测 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。结果以
将“2.3”项下冻存的血清在室温条件下静置 40 min x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
后，在 4 ℃下以 3 500 r/min 离心 10 min，取上清液，采用 比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
ELISA法检测大鼠血清中IL-1β、IL-6与TNF-α水平，采 3 结果
用全自动生化分析仪检测大鼠血清中 TC、TG、AST、 3.1 大鼠体征观察结果
ALT 水平，实验操作步骤严格按照相应说明书规定执 与空白组比较，模型组大鼠出现反应迟钝、精神萎
行。通过比较各给药组血清指标结果，选择效果最好的 靡现象；而给予仙方活命饮加减方与阳性对照药干预
一个仙方活命饮加减方剂量组与空白组、模型组共同进 后，各给药组大鼠上述症状均得到明显改善。
行代谢组学与肠道菌群的检测。 3.2 大鼠血清中炎症指标和肝功能指标的测定结果
2.5 大鼠肠道菌群16S rRNA测序分析 与空白组比较，模型组大鼠血清中炎症指标（IL-
通过 Illumina MiSeq 测序平台进行高通量分析，经 1β、IL-6、TNF-α）和肝功能指标（TC、TG、AST、ALT）水
过双端数据连接与去除嵌合体等步骤之后，利用高灵敏 平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠
度定量试剂盒及 DNA 文库试剂盒对文库做 2100 质检， 血清中炎症指标和肝功能指标水平均显著降低（P＜
并利用 DNA 文库试剂盒进行建库；运用荧光定量分析 0.05或P＜0.01）。结果见表1。
法对 16S rRNA V4 区有效序列进行 Miseq 的 2×300 bp 3.3 大鼠肠道菌群差异性分析结果
双端测序；使用 QIIME 软件、R 软件及 Mothur 软件等对 通过门水平的比较发现，空白组、模型组与仙方活
测序结果进行综合分析，通过高通量测序手段探寻大鼠 命饮加减方高剂量组大鼠肠道菌群主要分布于5个优势
[10]
肠道中的差异菌属 。 菌门，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actino‐
2.6 大鼠肝脏代谢组学分析 bacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacte‐
2.6.1 差异代谢物的检测 采用液质联用法测定大鼠 roidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia），见图 1。在属水
肝组织中的代谢产物。色谱条件为：采用 InfinityLab 平，通过对优势菌门所涉及的菌属进行比较发现，具有
Poroshell C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；以含 优势特征的菌属分别为阿克曼氏菌属（Akkermansia）、乳
0.05% 甲酸的乙腈溶液（A）-0.05% 甲酸溶液（B）为流动 杆菌属（Lactobacillus）、沃氏嗜胆菌属（Bilophila）、丁酸
性进行梯度洗脱（0～5 min，0→5%A；5～11 min，5%A→ 弧菌属（Butyricimonas）、粪球菌属（Coprococcus）、罗斯
中国药房 2023年第34卷第11期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 11 · 1345 ·
