Page 76 - 中国药房2023年10期
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2.3.2 细胞活力 采用 CCK-8 法进行测定。将对数生                      300 μL，下室加入含有 10% 胎牛血清的培养基 600 μL，
          长期hPDLSCs接种于96孔板中，按“2.2”项下方法分组，                     继续培养24 h后，取出Transwell小室，弃去上清液，棉签
          另设空白组（只含培养基，无细胞），各组设3个复孔。对                          擦去小室薄膜上层细胞，用PBS清洗后，以4%甲醇固定
          照组、LPS 组、黄芩苷不同浓度（0.1、1、10 mg/L）组按                   30 min。晾干后，用 0.1% 结晶紫水溶液染色 10 min，
         “2.2”项下方法给药后[上述实验组根据干预时间又分为                          PBS 清洗 3 次。置于倒置荧光显微镜下拍照，每孔随机
          24 h 和 48 h]，加入 CCK-8 溶液 10 μL，继续孵育 2 h。使           选取5个不同区域，采用Image J软件计算侵袭细胞数。
          用酶标仪于450 nm波长处测定各组光密度（optical den‐                  2.3.7 Cyclin D1和caspase-3 mRNA的相对表达量 采
          sity，OD）值，细胞活力（%）＝（实验组 OD 值－空白组                     用实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative
          OD 值）/（对照组 OD 值－空白组 OD 值）×100%。实验                   PCR，RT-qPCR）法进行测定。将对数生长期 hPDLSCs
          重复3次。                                               接种于 6 孔板中，按“2.2”项下方法进行分组与给药，取
          2.3.3 细胞增殖率 采用 EdU 法进行测定。将对数生                       干预24 h时对照组、LPS组、最适黄芩苷浓度组、抑制剂
          长期 hPDLSCs 接种于 12 孔板中，按“2.2”项下方法进行                  组的hPDLSCs，按RNA抽提试剂盒进行操作，提取细胞
          分组与给药，各组细胞干预 24 h（依据“2.3.2”项下结果                     样本总 RNA，采用超微量分光光度计检测 RNA 的浓度
          设置，下同）后，采用 EdU 处理，去除培养液，加入 4% 多                     及纯度，反转录合成模板链 cDNA，取反转录产物 2 μL
          聚甲醛溶液0.5 mL，固定细胞15 min，用0.5 mL 3%胎牛                 作为模板，用 SYBR Premix EX TaqⅡ试剂盒进行 RT-
          血清洗涤 3 次；用 0.5 mL 0.3%TritonX-100 去除胎牛血             qPCR检测。每个样品重复5次。以GAPDH为内参，采
          清，室温孵育 10 min，再用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 3                     用2 －ΔΔCt 法计算各目的基因的相对表达量。各目的基因
          次；12孔板中每孔加入Click反应液200 μL（现配现用），                    引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，
          室温避光孵育 30 min，洗涤 3 次去除 Click 反应液；加入                 具体序列及产物长度见表1。
          Hoechst 33258 染色液孵育 10 min；再洗涤 3 次后装片，                      表1 目的基因引物序列及产物长度
          置于倒置荧光显微镜下拍照，用Image J软件处理图片，                        基因        引物序列                         产物长度/bp
          以 EdU 阳性细胞（红色）占总细胞（蓝色）的百分比表示                        GAPDH     正向引物：5΄-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3΄  121
          细胞增殖率。                                                        反向引物：5΄-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3΄
                                                              Cyclin D1  正向引物：5΄-TCTACACCGACAACTCCATCC-3΄  129
          2.3.4 细胞凋亡率 采用 Hoechst 33258 染色法进行测                           反向引物：5΄-GCATTTTGGAGAGGAAGTGTTC-3΄
          定。将对数生长期 hPDLSCs 接种于 24 孔板中，按“2.2”                  caspase-3  正向引物：5΄-TTTTTCAGAGGGGATCGTTG-3΄  151
          项下方法进行分组与给药，各组细胞干预 24 h 后，用                                   反向引物：5΄-CGGCCTCCACTGGTATTTTA-3΄
          PBS洗涤2次（5 min/次）后，加入新鲜配制的4%多聚甲                      2.3.8 JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白、Cyclin D1 和
          醛溶液于 4 ℃下固定 10 min，然后用 PBS 洗涤 3 次去除                 caspase-3 蛋白的相对表达量 采用 Western blot 法进行
          固定液；Hoechst 33258 染色液（5 mg/L）染色 10 min，最            测定。将对数生长期hPDLSCs接种于6孔板，按“2.2”项
          后用 ddH2O 洗涤 3 次；晾干、封固，置于倒置荧光显微镜                     下方法进行分组与给药，干预24 h后，收集各组细胞，于
          下观察并拍照，采用Image J软件计算细胞凋亡率：细胞                        RIPA 裂解液冰上裂解，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 20
          凋亡率（%）＝凋亡细胞数/细胞总数×100%。                             min。取上清进行蛋白变性后，用凝胶电泳分离目的蛋
          2.3.5 细胞迁移率 采用划痕实验进行测定。将对数                          白，300 mA恒流转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，然后加入一
          生长期hPDLSCs接种于6孔板，按“2.2”项下方法进行分                      定稀释比例的一抗[JAK2（稀释比例为 1∶800）、STAT3
          组与给药，待细胞密度达到 90% 后，采用 20 μL 移液器                    （稀释比例为 1∶5 000）、p-JAK2（稀释比例为 1∶500）、
          枪头进行划痕，置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24 h。                    p-STAT3（稀释比例为 1∶500）、Cyclin D1（稀释比例为
          置于倒置荧光显微镜下拍照记录0、24 h时的划痕情况，                         1∶8 000）、caspase-3（稀释比例为 1∶2 000）及 β-actin（稀
          划痕面积分别记为S0与S24，细胞迁移率（%）＝（S0－S24 ）/                  释比例为 1∶5 000）]，于 4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤 3 次，
          S0×100%。                                            加入二抗（稀释比例为1∶2 000）孵育2 h，弃去液体，再用
          2.3.6 细胞侵袭能力 采用Transwell小室法进行测定。                    TBST洗涤3次，最后加显影液，使用全自动凝胶成像系
          将对数生长期 hPDLSCs 接种于 24 孔板中，按“2.2”项下                  统拍照记录。采用 Image J 软件分析蛋白灰度值，目的
          方法进行分组与给药。取－20 ℃保存的基质胶于 4 ℃                         蛋白相对表达量＝目的蛋白的蛋白灰度值/内参蛋白
          下过夜融化，用不含胎牛血清的培养基稀释基质胶浓度                           （β-actin）的蛋白灰度值。
          至 1 mg/mL。每小室加入基质胶稀释液 100 μL，置于                     2.4 统计学方法
          37 ℃、5%CO2 培养箱中培养 5 h，使其呈干胶状。将                          采用 SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料以
          Transwell 小室放入 24 孔板中，在 Transwell 小室的上室             x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
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          中，每孔加入不含胎牛血清的细胞悬液（1×10 个/mL）                        比较采用Tukey检验。检验水准α＝0.05。

          · 1218 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 10                            中国药房  2023年第34卷第10期
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