Page 75 - 中国药房2023年10期
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牙周组织由牙骨质、牙槽内衬骨、面向牙齿的牙龈                         海碧云天生物技术有限公司；Hoechst 33258染色试剂盒
          和牙周韧带组成，牙周炎会引起牙周组织被破坏，是导                          （批号20220304）购自江苏凯基生物技术股份有限公司；
          致成人牙齿脱落的重要原因 。传统的牙周炎治疗方                            0.1%结晶紫水溶液、青-链霉素（100×）均购自北京索莱
                                   [1]
          法，如刮治、根面平整及手术治疗通常只是姑息性的 ，                          宝科技有限公司；白细胞介素 6（interleukin 6，IL-6）、IL-
                                                       [2]
          治疗效果不理想。因此，了解牙周炎的发病机制并及时                           1β 和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）
          干预对治疗牙周炎具有重要作用。牙周膜干细胞是一                            ELISA 试 剂 盒（ 批 号 分 别 为 Feb2022、Mar2022、
          种体细胞干细胞，具有分化为多种细胞类型及自我更新                           Mar2022）均购自泉州市睿信生物科技有限公司；鼠抗人
          的潜力，被认为是非常有前景的用于牙周组织再生治疗                           JAK2单克隆抗体、磷酸化STAT3（p-STAT3）单克隆抗体
                    [3]
          的干细胞群 ，对牙周炎的治疗具有重要作用。                             （批号分别为 B2973、B3403）均购自美国 Santa Cruz 公
              现代研究表明，中药可通过消除致病因素、阻止病                         司；鼠抗人STAT3单克隆抗体（批号GR3411913-1）购自
          情发展和提高机体防御能力来发挥对牙周炎的治疗作                            北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人磷酸化 JAK2
            [4]
          用 。黄芩苷是从中药黄芩的根中提取分离得到的黄酮                          （p-JAK2）多克隆抗体（批号M2282997）购自沈阳万类生
          类化合物，具有抑菌、抗炎、抗肿瘤等药理作用，Chanaj-
                                                             物科技有限公司；鼠抗人细胞周期素 D1（Cyclin D1）单
                     [5]
          Kaczmarek等 认为黄芩苷可以治疗牙周炎，但抗炎的作                      克隆抗体、胱天蛋白酶 3（caspase-3）单克隆抗体、β-actin
          用机制尚不明确。Janus 蛋白酪氨酸激酶 2（Janus pro‐                 单克隆抗体及山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗（批号分
          tein tyrosine kinase 2，JAK2）/信号转导和转录激活因子3
                                                             别为10016419、10021291、10021787、20000425、20000509）
         （signal transduction and transcription activator 3，STAT3）
                                                             均购自武汉三鹰生物技术有限公司。
          信号通路可以参与细胞免疫、增殖分化、凋亡以及炎症
                                                             1.3 细胞
                            [6]
          反应等多种病理过程 ，且 STAT3 信号通路与牙周组织
                                                                 hPDLSCs 购自赛百慷（上海）生物技术股份有限
                              [7]
          炎症反应过程密切相关 ，但黄芩苷是否可以通过调控
                                                             公司。
          JAK2/STAT3 信号通路来影响人牙周膜干细胞（human
                                                             2 方法
          periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）的生物学行为
                                                             2.1 hPDLSCs的培养
          尚不清楚。基于此，本研究利用脂多糖（lipopolysaccha‐
                                                                 取hPDLSCs接种于含10%胎牛血清、1%青-链霉素
          ride，LPS）诱导 hPDLSCs 建立牙周炎细胞模型，探讨黄
                                                             的 DMEM 培养基中，于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每
          芩苷对其炎症因子、增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响，以及
                                                             隔2～3 d更换一次培养基，待细胞贴壁达80%以上进行
          对 JAK2/STAT3 信号通路的调控机制，旨在为牙周炎的
                                                             细胞传代，取对数生长期hPDLSCs用于后续实验。
          治疗提供新的理论参考。
                                                             2.2 细胞分组与给药
          1 材料
                                                                 取对数生长期的hPDLSCs，分为对照组、LPS组、黄
          1.1 主要仪器
                                                             芩苷不同浓度（0.1、1、10 mg/L）组。对照组不做干预，
              本研究所用主要仪器有 DXS_3 型倒置荧光显微镜
                                                             LPS 组以 10 μg/mL LPS 刺激 24 h 以构建体外炎症模
         （上海缔伦光学仪器有限公司），H4-20kr 型低温高速离                         [8]
          心机24孔板转子（湖南可成仪器设备有限公司），Multi‐                      型 ，黄芩苷不同浓度（0.1、1、10 mg/L）组在 LPS 组的基
                                                             础上加入 0.1、1 和 10 mg/L 黄芩苷 ，采用 ELISA 法和
                                                                                           [9]
          skan FC 型酶标仪、NanoDrop one 型超微量分光光度计
                                                             CCK-8法对炎症因子含量和细胞活力进行分析，以筛选
         （美国 Thermo Fisher Scientific 公司），A200 型聚合酶链
          式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（杭州朗基科          最适黄芩苷浓度（作为最适黄芩苷浓度组）进行后续通
          学仪器有限公司），OI1000型全自动凝胶成像系统（广州                       路验证实验。随后将细胞分为对照组、LPS 组、最适黄
          光仪生物科技有限公司）等。                                      芩苷浓度组、抑制剂组（抑制剂组在 LPS 组的基础上加
          1.2 主要药品与试剂                                        入最适浓度黄芩苷和3 μmol/L JAK2/STAT3通路抑制剂
                                                                   [10]
              黄芩苷对照品（纯度≥98%）、LPS（纯度≥98%）、                    AG490 ），各组设 3 个复孔，于 37 ℃、5%CO2培养箱中
          JAK2/STAT3 通路抑制剂 AG490（纯度≥99%）均购自上                 培养24 h。
          海源叶生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM 培养基均                         2.3 指标的测定
          购自美国Gibco公司；RIPA裂解液购自美国ABW公司；                      2.3.1 炎症因子含量 采用 ELISA 法进行测定。将对
          CCK-8 细胞计数试剂盒（批号 C6205060）、逆转录试剂                   数生长期 hPDLSCs 接种于 96 孔板中，按“2.2”项下方法
          盒（批号 H2017011）、SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒（批            分组与给药，于 37 ℃、5%CO2培养 24 h 后，收集各组细
          号 H4001330）均购自上海翊圣生物科技有限公司；5-乙                     胞上清液，按ELISA法测定对照组、LPS组、黄芩苷不同
          炔 基 -2′脱 氧 尿 嘧 啶 核 苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，    浓度（0.1、1、10 mg/L）组细胞中 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的
          EdU）细胞增殖检测试剂盒（批号092321220429）购自上                   含量，严格按照试剂盒说明书步骤操作。


          中国药房  2023年第34卷第10期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 10    · 1217 ·
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