Page 79 - 《中国药房》2022年17期

作用 24 h 后加入 RIPA 裂解液，于冰上裂解 30 min 后离 120 MCF-7/Ful细胞
MCF-7细胞
心（3 000 r/min，5 min），取上清液，凝胶电泳分离总蛋 100
白。电压开始设置为 80 V，当蛋白样品进入分离胶后， 80 a
电压提高到120 V，参照预染Marker的位置，待目的条带 相对细胞活力/％ 60 a a
进入凝胶最佳分离区时，停止电泳。在凝胶上面铺上经 40
甲醇和转膜液浸湿的 PVDF 膜，在 PVDF 膜上再放 3 层 20
浸过转膜液的滤纸，放上第2块海绵垫，放入转移槽中，槽 0
0 0.1 1 10 20 50
中灌满转膜液，打开电源，稳流200 mA（120 min）。转膜 Ful/（μmol/L）
结束后，取出PVDF膜并做好标记，用TBST洗膜10 min× a：与MCF-7细胞比较，P＜0.05
3次。将PVDF膜放入孵育盒中，加入含5％脱脂奶粉的 图1 Ful作用下MCF-7和MCF-7/Ful细胞的相对细胞
封闭液，摇床振荡1.5～2.0 h；封闭结束后，用TBST洗膜 活力折线图
10 min×3次。加入p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一 产生抑制，且具有剂量依赖趋势。当Ori和Ful联合使用
抗（稀释度均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入辣 时，与两者相应剂量单独使用时对比，MCF-7/Ful细胞的
根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（稀释度为1∶2 000），
抑制率均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），结果见表 1。
室温孵育 2 h，显影。采用 Image J 软件对蛋白条带进行
结果表明，Ori 能够逆转乳腺癌 MCF-7 细胞对 Ful 的耐
灰度值分析，以PI3K、Akt蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带
药，且与 Ful 联合使用后，逆转耐药效果更强。通过
灰度值的比值表示目标蛋白的表达水平，以 p-PI3K/
CompuSyn 软件绘制得到抑制率-联合指数关系图（图
PI3K、p-Akt/Akt比值分别表示PI3K、Akt的磷酸化水平。
2）。如图 2 所示，各剂量组联合指数均在横线下方，即
2.2 Ori 体内逆转乳腺癌 MCF-7 细胞对 Ful 耐药机制
[14]
联合指数均小于 1，具有协同作用 。当 Ori 剂量为 5
的验证
采用裸鼠移植瘤模型进行体内实验验证。将裸鼠 μmol/L、Ful剂量为8 μmol/L时，联合指数最小。
随机分为空白对照组、Ful 组（80 μmol/g）、Ori 组（50 表1 乳腺癌MCF-7/Ful细胞抑制率（x±±s，n＝4）
μmol/g）、Ful（80 μmol/g）+Ori（50 μmol/g）组，每组8只，分 Ori/（μmol/L） Ful Ful Ful Ful Ful
笼饲养。药物剂量由前期预实验结果确定。取“2.1.1” 0 μmol/L 4 μmol/L 8 μmol/L 16 μmol/L 20 μmol/L
0 0 14.23±1.32 28.31±2.36 35.1±4.23 42.12±5.69
项下MCF-7/Ful细胞，胰酶消化后，用生理盐水调整细胞 5 17.32±3.23 32.36±2.36 ab 55.32±5.63 ac 59.21±5.12 ac 60.63±5.41 ac
密度为1×10 个/mL，以每只裸鼠0.2 mL接种于裸鼠背部 10 31.64±4.23 39.69±5.12 ab 59.69±5.98 ab 69.32±6.12 ab 71.69±6.56 ac
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皮下，观察移植瘤的生长情况。待肿瘤生长至 100 mm 3 a：与相应剂量Ful单独使用比较，P＜0.05；b：与相应剂量Ori单独
左右时，按分组腹腔注射相应的药物或磷酸盐缓冲液， 使用比较，P＜0.05；c：与相应剂量Ori单独使用比较，P＜0.01
每4天1次，每次注射前用游标卡尺测量肿瘤的长径和短 2 Ful+Ori
径，持续28 d。肿瘤体积＝1/2长径×2倍短径。给药结束
后采用 CO2处死裸鼠，解剖裸鼠取出肿瘤，称量肿瘤质
量，计算抑瘤率。抑瘤率（％）＝[（空白对照组肿瘤质
量－给药组肿瘤质量）/空白对照组肿瘤质量]×100％。 联合指数
2.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料
以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
0
0 0.5 1
两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。 细胞抑制率/％
3 结果 图2 Ful和Ori联合使用的抑制率-联合指数关系图
3.1 MCF-7和MCF-7/Ful细胞相对细胞活力的检测结果
3.3 Ori 对乳腺癌 MCF-7/Ful 细胞中 PI3K/Akt 信号通
MTT 法检测结果显示，Ful 能够不同程度地抑制
路的影响
MCF-7 和 MCF-7/Ful 细胞增殖，且具有剂量依赖趋势。
与空白对照组比较，Ori 组和 Ful+Ori 组细胞中
当 Ful≥10 μmol/L 时，MCF-7/Ful 细胞的相对细胞活力
显著高于 MCF-7 细胞（P＜0.05），结果见图 1。在 Ful 作 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比 值 及 Ful 组 细 胞 中 p-PI3K/
用下，MCF-7/Ful细胞活力越大，代表其耐药性越强。 PI3K 比值均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）；与 Ful 组比
3.2 Ori对MCF-7/Ful细胞抑制率的影响及联合指数结果 较，Ful+Ori 组细胞中 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值均显
MTT 法检测结果显示，Ori 能够对 MCF-7/Ful 细胞 著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图3。

中国药房 2022年第33卷第17期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 17 ·2121 ·