Page 78 - 《中国药房》2022年17期
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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病                          伦理中心审批通过，伦理号：20191209-09。
        死率高 。据 WHO 国际癌症研究机构数据显示，2020                        2 方法
               [1]
        年乳腺癌全球新发226万例，占新发癌症病例的11.7％，                        2.1 Ori 体外逆转乳腺癌 MCF-7 细胞对 Ful 耐药机制
        成为全球第一大癌症。中国是乳腺癌大国，2020年新发                          的验证
        乳腺癌约42万例，并导致近12万人死亡 。化疗仍是目                          2.1.1  耐药细胞诱导及培养           将不耐药的正常乳腺癌
                                           [2]
        前治疗乳腺癌的主要方式，其在缩小病灶、减少手术造                            MCF-7细胞培养于含10％胎牛血清、200 U/mL 青霉素、
        成的伤残、提高乳腺癌患者生存率等方面具有较大优                             200 U/mL 链霉素的 DMEM 培养液中，并于培养液中加
          [3]
                                         [4]
        势 ，但耐药性是无法避免的现实问题 。氟维司群（ful-                        入 Ful，压力（Ful 浓度为 1 μmol/L）筛选 12 个月，诱导细
        vestrant，Ful）作为治疗乳腺癌的一种新型抗雌激素药                      胞耐药。然后调整 Ful 剂量为 0.5 μmol/L，置于 37 ℃、
          [5]
        物 ，其耐药性问题仍是急需突破的瓶颈                 [6－8] 。          5％CO2培养箱中继续培养至对数生长期，即得对Ful耐药
            冬凌草甲素（oridonin，Ori）是从冬凌草植物中提取                   的乳腺癌MCF-7/Ful细胞，用于后续实验。药物剂量参考
        的二萜类化合物，具有良好的抗肿瘤活性，对白血病细                            文献[13]和前期预实验结果设置。
        胞、胃癌细胞的耐药性具有较好的逆转作用                    [9－11] 。相关   2.1.2 MCF-7和MCF-7/Ful细胞相对细胞活力检测 采
        研究表明，通过调控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylino-                用MTT法进行检测。取对数生长期的正常MCF-7细胞
        sitol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）   及“2.1.1”项下 MCF-7/Ful 细胞，接种至 96 孔板中，每
                                              [12]
        信号通路，可以达到逆转肿瘤耐药性的效果 。本团队                            孔 3 000个细胞。将细胞置于37 ℃、5％CO2培养箱中培
        前期通过研究证明 Ori 可能通过诱导乳腺癌 MCF-7/Ful                    养过夜，待细胞完全贴壁后，根据预实验结果，每孔加入
        细胞产生DNA损伤，引起细胞凋亡、细胞周期阻滞及细                           不同浓度[0（对照）、0.1、1、10、20、50 μmol/L]的Ful，每个
        胞自噬，从而逆转乳腺癌 MCF-7 细胞对 Ful 的耐药 。                     浓度设置4个复孔；另设空白培养基组，药物剂量参考文
                                                     [13]
        因此，本研究拟通过检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的                        献[13]和前期预实验结果设置。药物作用 48 h 后，每孔
        表达，以及裸鼠肿瘤质量和体积的变化，进一步探讨Ori                          加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h 后，每孔再
        逆转乳腺癌MCF-7细胞对Ful耐药的机制。                              加入三联裂解液（盐酸+十二烷基硫酸钠+异丙醇）200
        1 材料                                                μL，于 37 ℃恒温培养箱中放置 18 h 后，使用酶标仪在
        1.1  主要仪器                                           570 nm 波长处测定各孔的光密度（OD），并计算相对细
            本研究所用主要仪器包括BB150型CO2培养箱（美                       胞活力。相对细胞活力（％）＝（实验组 OD570－空白培
        国 Thermo Fisher Scientific 公司）、TDL-4 型低速离心机         养基组 OD570 ）/（对照组 OD570－空白培养基组 OD570 ）×
        （浙江纳德科学仪器有限公司）、Mini-PROTEAN型电泳                      100％。实验重复3次。
        仪（美国Bio-Rad公司）、ChemiScope 6200 Touch 型化学            2.1.3 MCF-7/Ful 细胞抑制率及联合指数检测               采用
        发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）、FA1004N                        MTT法进行检测。取“2.1.1”项下MCF-7/Ful细胞，接种
        型电子天平（上海仪天科学仪器有限公司）等。                               至96孔板中，每孔3 000个细胞。待细胞贴壁后，用不同
        1.2  主要药品与试剂                                        浓度的 Ori[0（对照）、5、10 μmol/L]和 Ful[0（对照）、4、8、
            本研究所用主要药品与试剂包括 Ori 对照品（上海                       12、16、20 μmol/L]单独及联合使用处理细胞 48 h，每个
        源叶生物科技有限公司，纯度≥98％），Ful对照品（美国                        浓度设置 4 个复孔。药物剂量依据前期预实验结果设
        Sigma公司，纯度≥98％），DMEM培养液、胎牛血清（美                      置。每孔加入MTT溶液20 μL，培养4 h后，再加入三联
        国Hyclone公司），MTT（北京索莱宝科技有限公司，批号                      裂解液（盐酸+十二烷基硫酸钠+异丙醇）200 μL，继续放
        1021C018），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生                      置 18 h 后，使用酶标仪在 570 nm 波长处测定 OD，并计
        物技术有限公司，批号 P0032），兔源 PI3K、磷酸化 PI3K                  算细胞抑制率。细胞抑制率（％）＝（对照组 OD570－实
        （p-PI3K）、Akt、磷酸化 Akt（p-Akt）、甘油醛-3-磷酸脱氢              验组 OD570 ）/对照组 OD570×100％，实验重复 3 次。采用
        酶（GAPDH）抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG                        CompuSyn 软件绘制不同联合效应下的抑制率-联合指
        二抗（美国CST公司），青霉素、链霉素（杭州吉诺生物医                         数关系图，计算不同剂量组合下的联合指数。
        药技术有限公司）等。                                          2.1.4 MCF-7/Ful 细胞中 PI3K/Akt 信号通路相关蛋白
        1.3 细胞与动物                                           的检测     采用 Western blot 法进行检测。取“2.1.1”项下
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            人乳腺癌 MCF-7 细胞株购自中国科学院上海细胞                       MCF-7/Ful细胞接种至6孔板中，每孔6×10 个细胞。将
        库。SPF级BALB/c裸鼠，4周龄，雄性，体质量20～25 g，                   细胞随机分为空白对照组、Ful 组（5 μmol/L）、Ori 组（8
        购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产合格                            μmol/L）、Ful（5 μmol/L）+Ori（8 μmol/L）组，每组设置 4
        证号为SCXK（沪）2017-0009，饲养于浙江中医药大学实                     个复孔。待细胞贴壁后，按上述分组加入相应的药物或
        验动物中心。本研究经衢州职业技术学院医学院动物                             磷酸盐缓冲液。药物剂量依据前期预实验结果设置。


        ·2120 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 17                                 中国药房    2022年第33卷第17期
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