Page 103 - 《中国药房》2022年5期

（C-20），33.9（C-21），32.4（C-22），28.0（C-23），16.9 200 μL Binding Buffer，采用流式细胞仪检测细胞凋亡
（C-24），15.6（C-25），17.4（C-26），25.9（C-27），176.4 率。试验重复3次。结果显示，24 h组和72 h组中U87MG
（C-28），33.1（C-29），23.6（C-30），Ara C-1～C-5（104.9， 细胞产生明显凋亡现象，24 h组的早期和中晚期凋亡细
76.3，74.0，79.6，64.5），3-O-Rha C-1～C-6（101.7，72.3， 胞分别占8.0％和21.7％，72 h组该占比分别为18.7％和
72.5，74.0，69.8，18.6），3-O-Glc C-1～C-6（106.4，75.5， 39.6％，呈一定时间依赖趋势。结果见图3。
78.5，71.2，78.8，62.5），GlcⅠ C-1～C-6（95.6，73.8，78.7，
10 5 10 5
70.8，78.0，69.2），GlcⅡ C-1～C-6（104.9，75.3，76.5，78.2，
10 4 10 4
77.1，61.2），28-O-Rha C-1～C-6（102.7，72.5，72.7，74.0，
PI 10 3 PI 10 3
[30]
70.3，18.5）。对比参考文献波谱数据 ，鉴定该化合物
10 2 10 2
为hederacolchiside E。 －10 2 －10 2
0 10 2 10 3 10 4 10 5 0 10 2 10 3 10 4 10 5
2.4 抗肿瘤活性研究 Annexin V-FITC Annexin V-FITC
2.4.1 抑制肿瘤细胞增殖活性 采用MTT法检测所得 A.空白对照组 B. 24 h组
化合物对 HL-60 细胞、A549 细胞、HepG2 细胞、HeLa 细 10 5
胞和 U87MG 细胞增殖的抑制作用。收集对数生长期 10 4
3
的上述细胞，置于 96 孔板中，调整细胞密度至 1×10 ～ PI 10 3
1×10 个/孔，每孔200 μL，加待测化合物（浓度分别为0、 10 2
4
2、4、8、16、32、64 μmol/L），以多柔比星和尼莫司汀为阳 －10 2
0 10 2 10 3 10 4 10 5
性对照，各浓度设3个复孔，在培养箱内培养72 h后，每 Annexin V-FITC
C. 72 h组
孔加 20 μL MTT 试剂染色，继续培养 4 h；弃上层培养
图3 化合物7对U87MG细胞凋亡率的影响
液，每孔加入 150 μL DMSO，振荡 10 min，在酶标仪 490
nm波长下检测吸光度，计算半数抑制浓度（IC50 ）。结果 3 讨论
如表2所示，化合物3、4、6～9均表现出不同程度的抑制 本研究采用多种色谱技术，从小花草玉梅根茎中分
肿瘤细胞增殖活性；其中化合物7活性最强，抑制细胞增 离纯化得到16个化合物，根据波谱数据和理化性质鉴定
殖的 IC50为 8.21～16.82 μmol/L。而其余化合物未显示 了它们的化学结构，所得化合物均为齐墩果烷型三萜皂
对测试细胞株有增殖抑制活性。 苷，包含 2 种苷元：齐墩果酸型皂苷元和常春藤型皂苷
表 2 化合物 1～16 抑制 5 种人源肿瘤细胞增殖的 IC50 元。经系统文献检索，化合物1为新化合物。通过MTT
（x±±s，n＝3，μmol/L） 法检测所得化合物对 5 种人源肿瘤细胞（HL-60 细胞、

化合物 a HL-60 HepG2 A549 HeLa U87MG A549细胞、HepG2细胞、HeLa细胞和U87MG细胞）的增
3 3 22.32±0.78 31.85±0.96 25.10±1.02 36.98±1.45 24.17±0.87 殖抑制活性，结果显示所有双糖链皂苷均无活性，且在
4 4 22.43±1.12 25.98±1.02 32.62±1.53 29.62±1.45 19.06±0.65 苷元 C-28 位连糖基的单糖链皂苷（化合物 8、9）活性亦
6 6 13.87±0.87 17.61±0.32 19.12±0.85 21.04±0.69 19.60±0.69
7 7 8.21±0.34 10.05±0.46 16.82±0.58 14.22±0.83 8.64±0.21 较弱，提示这类三萜皂苷结构中苷元 C-3 位连糖基且
8 8 34.57±1.16 55.22±2.14 43.08±1.49 49.51±1.52 64.83±3.22 C-28 位为游离羧基是具备活性的必要条件。苷元 C-3
9 9 57.20±1.82 84.98±2.59 ＞100 ＞100 57.24±2.15 位糖链存在 Rha（1→2）Ara-结构片段的皂苷（化合物 6、
多柔比星 0.35±0.05 0.50±0.04 0.68±0.10 0.66±0.07 -
尼莫司汀 - - - - 0.72±0.03 7）活性较强；糖链结构相同的皂苷（化合物6、7），齐墩果
a：化合物1、2、5、10～16未显示细胞增殖抑制活性，略去 酸型皂苷元皂苷活性强于常春藤型皂苷元皂苷，推测苷
2.4.2 流式细胞术检测细胞凋亡 根据抑制肿瘤细胞 元 C-23 位羟基对活性存在削弱作用。以上结论验证了
增殖活性实验结果，选取化合物7作用于U87MG细胞， 已报道的有关齐墩果烷型三萜皂苷抗肿瘤的构效关
采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测其对U87MG细胞凋 系 [31－33] 。此外，通过流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染
亡的影响。细胞生长至对数增殖期，设2个实验组（24 h 试验，发现化合物7能诱导U87MG细胞凋亡，且呈一定
组、72 h 组）和空白对照组，去除原培养液，实验组加入 时间依赖趋势，可以推测其通过促进肿瘤细胞的凋亡来
药物浓度为 8.6 μmol/L 的培养液，空白对照组加入空白 抑制肿瘤细胞生长，但细胞凋亡机制较为复杂，需要通
培养液，培养一定时间后，用胰酶消化吹打为细胞悬液， 过进一步的研究明确该化合物促凋亡的调节因子及相
调整细胞密度至5×10 个/mL，取1 mL离心（2 000 r/min， 关信号通路。
5
5 min），PBS洗涤2次，再离心（2 000 r/min，5 min），加入 综上所述，本研究丰富了银莲花属植物三萜皂苷类
300 μL Binding Buffer 重悬；加入 5 μL Annexin V-FITC 活性成分的物质基础，并为其抗肿瘤活性的进一步开发
和5 μL PI（碘化丙啶），混匀，室温避光培养15 min，加入 提供了参考和依据。

中国药房 2022年第33卷第5期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 5 ·609 ·