Page 38 - 《中国药房》2021年23期
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阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号为                            项下于 4％多聚甲醛溶液中浸泡 24 h 的大鼠心肌组织，
        SCXK（京）2020-0004。大鼠购入后饲养于温度 22～                     常规制备石蜡切片（厚度为 4 μm），然后行常规 HE 染
        25 ℃、相对湿度 40％～60％的动物房中。本研究中动                        色。将染色后的组织切片置于显微镜下观察（心肌细胞
        物实验方案经华北理工大学实验动物伦理委员会审查                             核呈蓝色、细胞质呈红色）。
        批准后实施（批准号为LX2019084）。                               2.7 心肌细胞凋亡指数测定
        2 方法                                                    每组随机选取3个样本，采用TUNEL染色法进行测
        2.1 T2DM大鼠模型的建立                                     定。取“2.4”项下于20％蔗糖溶液中保存的大鼠心肌组
            将 60 只大鼠适应性喂养 1 周后分为正常组（n＝8）                    织，用 OTC 包埋剂包埋后冰冻切片，将切片用 4％多聚
        和造模组（n＝52）。正常组大鼠饲以正常饲料，造模组                          甲醛溶液固定30 min；用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，
        大鼠饲以高糖高脂饲料。饲养4周后，造模组大鼠一次                            加入含 0.5％Triton X-100 的 PBS，于室温孵育 5 min；用
        性腹腔注射 30 mg/kg STZ 溶液（pH＝4.4），正常组大鼠                 PBS 洗涤 2 次，滴加 TUNEL 检测液，于 37 ℃避光孵育
        腹腔注射等体积的生理盐水。3 d 后，检测造模组大鼠                          60 min；用 DAPI 封片，然后置于荧光体式显微镜下观
        的空腹血糖值，以空腹血糖值≥11.1 mmol/L 为判断                       察（凋亡细胞呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光）。采用
        T2DM 模型构建成功的标准 。结果，本研究的成模率                          Image J 1.46r软件记录每个视野中的凋亡细胞数量和总
                                 [16]
        约为92％（共有48只大鼠建模成功）。                                 细胞数量，计算心肌细胞凋亡指数：凋亡指数（％）＝（凋
                                                                                    [19]
        2.2 动物分组与给药                                         亡细胞数/细胞总数）×100％ 。
            将造模成功的 40 只大鼠按随机数表法随机分为模                        2.8 心肌组织中Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达测定
                                          [16]
        型组、阳性对照组（二甲双胍 90 mg/kg ）和芍药苷高、                      2.8.1  免疫组化法测定        每组随机选取3个样本进行实
        中、低剂量组（90、60、30 mg/kg ），每组8只。正常组和                   验。按“2.6”项下方法制备石蜡切片，以二甲苯和梯度乙
                                  [17]
        模型组大鼠灌胃生理盐水，各给药组大鼠灌胃相应药液                            醇进行脱蜡和水合后，滴加 EDTA 溶液进行抗原修复；
        （均以生理盐水为溶剂溶解），灌胃体积均为7.5 mL/kg，                      滴加3％过氧化氢溶液，于室温静置15 min；用PBS冲洗
        每天 1 次，连续 4 周。灌药期间正常组大鼠继续饲以正                        3次、每次5 min，然后加入Bax一抗（稀释比例1∶1 000）、
        常饲料，其余各组大鼠均继续饲以高糖高脂饲料。                              Bcl-2一抗（稀释比例1∶2 000）、caspase-3一抗（稀释比例
        2.3  体质量、空腹血糖值测定和口服葡萄糖耐量实验                          1 ∶ 5 000），于 4 ℃孵育过夜；滴加 HRP 标记的山羊抗兔/
            在灌胃前及灌胃第 1、2、3、4 周时，分别测定大鼠体                     小鼠 IgG 二抗，于室温孵育 10 min；用 PBS 冲洗 3 次、每
        质量。在灌胃前和灌胃第4周时，分别测定大鼠的空腹                            次5 min，进行DAB 显色，然后以苏木精复染；用水冲洗
        血糖值（空腹血糖值测定前，大鼠先禁食不禁水 12 h）。                        后，再进行脱水、封片，然后将组织切片置于显微镜下进
        在第4周灌胃结束后进行大鼠口服葡萄糖耐量实验：按                            行观察（目标蛋白的阳性表达呈棕褐色），并采用 Image
        2 g/kg 的剂量灌胃大鼠 50％葡萄糖注射液，分别于灌胃                      J 1.46r软件分析各蛋白的平均光密度值（平均光密度值
        葡萄糖注射液后第0、15、30、45、60、120 min时测定大鼠                  越大，表示蛋白表达水平越高）。
        血糖值，并计算血糖的曲线下面积（AUC）：AUC＝[（血                        2.8.2 Western blot 法测定   每组随机选取 3 个样本进
        糖值 0 min+血糖值 30 min ）×15/60+（血糖值 30 min+血糖值 60 min ）×  行实验。取“2.4”项下冻存的大鼠心肌组织，加入 RIPA
        15/60+（血糖值 60 min+血糖值 120 min ）×30/60] 。            裂解液提取组织中的总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒
                                          [18]
        2.4  样本取材及处理                                        说明书方法测定蛋白的质量浓度后，将蛋白在100 ℃条
            口服葡萄糖耐量实验后，于大鼠腹主动脉采血5 mL，                       件下加热变性。取变性后蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚
        然后以3 000 r/min离心血样10 min，收集血清，于 －80 ℃               丙烯酰胺凝胶电泳（分离胶电压80 V，浓缩胶电压120 V，
        保存，备用。取血后，将大鼠处死，取其心肌组织，以冰                           电泳时间 105 min），然后电转至聚偏二氟乙烯膜上
        生理盐水冲洗后用滤纸吸干。将一部分心肌组织置于                            （电流220 mA，转膜时间1 h），加入牛血清白蛋白（BSA）
        4％多聚甲醛溶液中浸泡 24 h；将另一部分心肌组织放                         封闭液封闭 2 h；用 TBST 洗膜 3 次、每次 10 min，分别加
        入20％蔗糖溶液中；将剩余的心肌组织迅速置于液氮中                           入β-actin 一抗（稀释比例 1 ∶ 1 000）、Bax 一抗（稀释比例
        保存，然后转至－80 ℃冰箱中长期保存，备用。                             1 ∶ 1 000）、Bcl-2 一抗（稀释比例 1 ∶ 2 000）和 caspase-3 一
        2.5 血清中生化指标测定                                       抗（稀释比例1 ∶ 5 000），于4 ℃孵育过夜；用TBST洗膜3
            取“2.4”项下血清，分别测定血清中血脂指标（GSP、                     次、每次 10 min，加入 HRP 标记的山羊抗兔/小鼠 IgG 二
        TC、TG）、氧化应激相关指标（GSH-Px、SOD、MDA）和                    抗（稀释比例1 ∶ 10 000），于室温孵育2 h；用超敏ECL化
        心肌损伤特异性诊断指标（CK-MB、cTnⅠ）的水平。上                        学发光试剂显影、曝光。使用 Image Lab 5.2.1 软件测定
        述指标的测定均按照对应试剂盒说明书方法操作。                              各蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参
        2.6  心肌组织病理形态学观察                                    β-actin 蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达
            采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。取“2.4”                      水平。


        ·2848 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23                                 中国药房    2021年第32卷第23期
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