Page 46 - 中国药房2021年11期
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象，建立氧糖剥夺损伤模型，通过检测细胞凋亡情况和                            取新生大鼠，置于 75％乙醇中浸泡5 min，于无菌条件下
        凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白                    取出其脑组织，分离海马组织，以PBS洗净残血后剪碎，
        （Bax）、激活型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）]的表达，             放入无菌离心管中，加入0.125％胰蛋白酶，于37 ℃条件
        探讨β-乳香酸对海马神经元细胞氧糖剥夺损伤的改善                            下水浴 5 min 进行消化；将消化后的混悬液反复吹打溶
        作用，以期为β-乳香酸防治缺血性脑血管疾病提供实验                           液 ，静 置 ，待 自 然 沉 淀 后 弃 去 上 清 液 ；沉 淀 中 加 入
        依据。                                                 0.125％胰蛋白酶继续消化，待自然沉淀后收集上清液；
        1 材料                                                然后向上清液中加入含 10％胎牛血清和青/链霉素的
        1.1 主要仪器                                            DMEM培养基以中和消化酶，然后以70 μm孔径的一次
            本研究所用主要仪器有：HF-90型CO2培养箱（上海                      性细胞滤网过滤，取上清液，以 1 000 r/min 离心 7 min，
        力申科学仪器有限公司），IX53型倒置相差显微镜（日本                         弃上清液；将沉淀接种至多聚赖氨酸包被的6孔板中，于
        Olympus公司），ELX-800型酶标仪（美国Bio-Tek公司），                37 ℃、5％CO2 恒温箱中培养 8 h 后，换成含 2％B27 和
        H-2050R型超速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发                         0.5 mmol/L L-谷氨酰胺及 100 U/mL 青/链霉素的 Neuro-
        有限公司），SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州净化设备有                       basal 培养基中培养 48 h，然后加入 10 μmol/L 阿糖胞苷
        限公司），NW10LVF 型超纯水系统（力康生物医疗科技                        抑制胶质细胞生长，每隔3 天换液1次，培养7～10天后
        控股有限公司），DYY-7C 型电泳仪、WD-9413B 型凝胶                    进行后续试验。
        成像系统（北京六一生物科技有限公司），NovoCyte型流                       2.2 海马神经元细胞分组、造模与给药
        式细胞仪（艾森生物有限公司），DH36001B 型电热恒温                           取海马神经元细胞分为正常对照组、模型组和β-乳香
        培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）。                                   酸不同浓度组（1、10、100 μmol/L，浓度根据文献[11－12]
        1.2  主要药品与试剂                                        设置）。正常对照组和模型组加入含 2％B27 和 0.5
            本研究所用主要药品与试剂有：β-乳香酸（上海纯                         mmol/L谷氨酰胺的Neurobasal培养基1 mL；β-乳香酸各
        优生物科技有限公司，批号P1513，纯度不低于95％），胰                       浓度组加入含相应药物以及含 2％B27 和 0.5 mmol/L
        蛋白酶（上海中乔新舟生物科技有限公司，批号 0103），                        L-谷氨酰胺的 Neurobasal 培养基 1 mL。各组细胞于
        DMEM培养基（美国Hyclone公司，批号SH30027），胎牛                   37 ℃、5％CO2恒温箱中培养24 h后，将β-乳香酸各浓度
        血清（以色列BI公司，批号04-011-1A），Neurobasal培养                组和模型组的培养基更换为无糖 DMEM 培养基，并将
        基、L-谷氨酰胺、细胞培养添加剂B27（美国Gibco公司，                      细胞置于缺氧造模盒内，通入混合气体（含有 95％N2、
        批号分别为 12348-017、25030-149、17504-044），阿糖胞            5％CO2 ），于 37 ℃培养箱中培养 2 h 以诱导建立氧糖剥
        苷（日本 TCI 公司，批号 C2035），磷酸盐缓冲液（PBS）、                  夺模型   [13－14] ；正常对照组继续用含2％B27和0.5 mmol/L
        二甲基亚砜（DMSO）、蛋白上样缓冲液、碘化丙啶（PI）、                       谷氨酰胺的 Neurobasal 培养基培养，不作缺氧缺糖处
        细胞裂解液、ECL发光液（上海碧云天生物技术研究所，                          理。造模结束将各组培养基更换为含 2％B27 和 0.5
        批 号 分 别 为 ST476、ST038、P0015、ST511、P0013、            mmol/L L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基（β-乳香酸各浓
        P0018），MTT 试剂、乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒、                      度组继续加入相应药物）。
        BCA 蛋白浓度测定试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、辣根                          2.3  海马神经元细胞存活率的测定
        过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）                            采用MTT法进行检测。取“2.1”项下海马神经元细
        二抗、兔抗大鼠cleaved caspase-3单克隆抗体、兔抗大鼠                  胞，以 5×10 个/孔接种于 96 孔板中，然后按“2.2”项下方
                                                                      3
        Bcl-2 单克隆抗体、兔抗大鼠Bax单克隆抗体、兔抗大鼠                       法分组、造模与给药，每组设 3 个复孔。细胞于 37 ℃、
        β-actin单克隆抗体（沈阳万类生物科技有限公司，批号分                       5％CO2恒温箱中培养 24 h 后，加入 MTT 染色液 20 μL，
        别为 WLA021、WLA072、WLA004、WLA001、WLA023、              继续培养4 h；弃去上清液，加入DMSO 150 μL以溶解细
        WL02117、WL01556、WL01637、WL01372）。                   胞，避光静置10 min后，采用酶标仪于570 nm波长下测
        1.3 动物                                              定各孔吸光度值（OD），并计算细胞存活率[细胞存活率
            本研究所用动物为SPF级SD新生大鼠（出生2天），                      （％）＝（OD 实验组/OD 正常对照组 ）×100％]。实验重复3次。
        雄性，购自第四军医大学实验动物中心，实验动物生产                            2.4 海马神经元细胞上清液中LDH活性的测定
        许可证号为SCXK（陕）2019-001。大鼠的饲养环境温度                          采用化学比色法进行检测。取“2.1”项下海马神经
        为（22±1）℃、湿度为 45％～55％，饲养过程中大鼠自                       元细胞，以 5×10 个/孔接种于 96 孔板中，然后按“2.2”项
                                                                          3
        由进食饮水。                                              下方法分组、造模与给药，每组设 3 个复孔。细胞于
        2 方法                                                37 ℃、5％CO2恒温箱中培养 24 h 后，取培养液上清液，
        2.1  原代海马神经元细胞的分离与培养                                根据 LDH 测定试剂盒说明书方法操作，采用酶标仪于
            参考文献[10]并对方法改良后进行细胞分离培养。                        440 nm波长处测定各孔OD，并计算LDH 活性。


        ·1320 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 11                                 中国药房    2021年第32卷第11期
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